猪瘟胶体金免疫快速检测技术研究进展

梅建国 ，庄金秋 ，张 颖 ，马 力 ，李 峰

（1. 滨州贝尔凯瑞生物技术有限公司，山东 滨州 256600；2. 山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种严重危害养猪业的毁灭性传染病。加强CSFV检测技术的研究对预防和控制本病具有重要的现实意义。胶体金免疫技术是在胶体金标记技术、免疫检测技术基础上发展起来的一种新型免疫学检测技术，目前在动物医学检测方面主要有斑点免疫金渗滤法（Dot-immuogold filtration assay，DIGFA）和胶体金免疫层析技术（Gold immunochromatography assay，GICA）。这两种检测方法均具有操作简便、快速、无污染、不需特殊仪器、特异性强、敏感性高、结果判断直观等优点[1]。胶体金免疫技术在猪瘟疫病快速诊断、大批量检测、大面积普查等领域得到了广泛应用，受到了基层兽医人员的青睐，具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景[2]。本文概述了胶体金免疫技术在猪瘟抗原及抗体快速检测上的应用研究进展，以期为猪瘟的有效防控提供参考。

1　胶体金免疫技术原理

胶体金免疫技术是继20世纪80年代三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）后发展起来的一种新型标记技术。该技术以胶体金为标记物，利用抗原抗体的特异性反应，对抗原（或抗体）物质进行定性、半定量乃至定量研究的一种新型体外快速免疫学检测技术[3]。

2　基于胶体金免疫技术的猪瘟检测方法

2.1 猪瘟抗原检测

陈龙宾等[4]采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金，选择15 nm胶体金标记兔抗CSFV多克隆抗体，对胶体金标记抗体采用低温超速离心法进行纯化，在硝酸纤维素膜的不同位置分别包被羊抗兔IgG（质控线）和兔抗CSFV多抗IgG（检测线），研制出可检测CSFV的免疫层析试纸条。应用该法及直接猪瘟荧光抗体试验、RT-PCR试验同时对猪瘟可疑病料进行检测，阳性检出率分别为36.4%、45.5%和72.7%，虽然阳性检出率较后两者低，但该法操作简便、耗时短，可用于猪瘟的流行病学调查，更易于在基层推广和应用。张长弓等[5]应用胶体金标记技术与免疫层析技术相结合，在玻璃纤维膜、硝酸纤维膜的检测线（T）和对照线（C）上分别喷上胶体金与CSFV单克隆抗体（Ab2）的偶联物、Ab2和羊抗鼠IgG多克隆抗体，制成检测CSFV的胶体金快速检测试纸。用该试纸检测猪瘟弱毒活疫苗和猪瘟脾淋弱毒苗均显阳性，而对猪源性的其他病毒、细菌抗原均显阴性。杨明等[6]采用柠檬酸钠还原法制备胶体颗粒，用胶体金标记CSFV特异性单克隆抗体，将纯化的CSFV抗体和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维膜上作为检测线和质控线，研制检测CSFV的快速诊断试纸条。用该试纸条检测了70份临床待检样品，与病毒分离鉴定的符合率为92.8%。付连军等[7]采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金，选择15 nm胶体金标记兔抗CSFV纯化后的多抗，组装免疫层析试纸条，用试纸条和荧光抗体试验同时对8份猪瘟可疑病料进行检测，阳性符合率为83%。张露露[8]采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记纯化的抗CSFV E0单克隆抗体E01作为捕捉抗体，将纯化的抗CSFV E0单克隆抗体E02和羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和质控线，制备了双抗夹心法CSFV胶体金免疫层析试纸条，可检测出纯化的CSFV，并有明显显色。

2.2 猪瘟抗体检测

斑点免疫金渗滤法微量、特异、敏感可靠、检测时间短、效果直观、非常适用于猪瘟的早期诊断、普查及疫苗免疫后抗体水平的检测[9]。孔繁德等[10]以CSFV包被硝酸纤维素膜，通过胶体金标记金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）直接显色，阳性者出现红色斑点，建立了检测CSFV抗体的斑点免疫金渗滤法。整个试验过程仅需5 min，操作简单。应用该方法与Dot-ELISA、间接血凝试验（IHA）同时对200份猪血清样品进行检测，与二者的符合率分别达98.4%和98.9%。王荣等[11]在单重斑点免疫金渗滤法的基础上，将提纯的CSFV和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗原同时包被在硝酸纤维膜素上，利用胶体金标记SPA显色，建立了能同时检测CSFV和PRRSV两种抗体的双重斑点免疫金渗滤法，特异性高、重复性好，大大提高了检测效率。陈善真等[12]利用人工筛选合成的CSFV多肽和PRRSV多肽葡聚糖偶联物作为包被抗原，以多肽—Biotin－链霉亲和素作为胶体金标记物，羊抗猪IgG包被硝酸纤维素膜作为质控带，建立了一种同时检测CSFV和PRRSV抗体的双抗原夹心胶体金免疫层析方法。与IDEXX ELISA试剂盒平行检测CSFV抗体总体符合率为86.36%；PRRSV抗体总体符合率为83.33%。本方法的建立可为多肽抗原在畜禽疾病诊断方面的应用奠定基础。由于CSFV分离、培养、纯化较困难，用基因工程技术来体外重组表达CSFV保护性抗原基因的E2蛋白，用该蛋白或其单抗做金标抗原或抗体，可避免纯化病毒的麻烦。王丽等[13]利用基因工程方法将CSFV C株Erns和E2基因主要抗原域连接后在原核表达系统中表达，获得嵌合蛋白CnC2，将纯化后的嵌合蛋白进行胶体金标记，并在硝酸纤维素膜上包被抗CnC2单克隆抗体，建立了检测猪瘟抗体的免疫层析试纸条，敏感性和特异性分别高达97%和100%，非常适合猪瘟抗体滴度的临床检测和调查。尹梅[14]将CSFV重组E2蛋白标记胶体金作为捕捉抗原，纯化CSFV E2蛋白和兔抗E2多克隆抗体包被在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上，特建立了检测CSFV抗体的双抗原夹心胶体金免疫层析试纸条方法。应用该试纸条和IDEXX ELISA检测试剂盒，分别检测来自江苏太湖和浦口的共计80份血清样品，两种检测方法的符合率为90.3%，取得了理想的检测效果。

2.3 猪瘟强、弱毒鉴别检测

CSFV E2蛋白能刺激动物机体产生中和抗体，在不同毒株间高度保守，是CSFV最重要的保护性抗原，可用于建立猪瘟血清学检测方法。刘畅等[15]、郑鸣等[16]、王慧杰等[17]、李华玮等[18]先后以猪瘟兔化弱毒E2基因表达后的纯化蛋白为弱毒抗原，以PK-15细胞培养纯化后的猪瘟病毒强毒为强毒抗原进行胶体金标记，运用双抗原夹心法建立了能区分猪瘟强、弱毒的检测猪瘟抗体的免疫层析试纸条方法。夏照和[19]采用环磷酰胺免疫抑制法，用纯化的杆状病毒表达的猪瘟疫苗株（HCLV株）E2蛋白作为耐受原，石门株E2蛋白作为免疫原免疫小鼠，获得抗E2蛋白单克隆抗体。该单克隆抗体可以用于鉴别猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株，为研究猪瘟强毒和弱毒之间的分子差异奠定了基础。王向鹏等[20]利用CSFV E2蛋白的单克隆抗体为捕捉抗体，建立了快速、简便的检测CSFV野毒的胶体金免疫层析方法。其检出病毒培养物的最低检测限为103.5TCID50，具有良好的特异性、敏感性和重复性，初步达到了区分检测CSFV野毒株和弱毒株的目的。彭伍平等[21]利用杆状病毒表达了CSFV石门株和兔化弱毒疫苗株E2蛋白，以石门株E2蛋白为免疫原免疫小鼠，制备了一株抗CSFV石门株E2蛋白的单抗（McAb）6E10，该单抗与兔化弱毒疫苗株不反应。王向鹏[22]在此基础上又以纯化的McAb 6E10标记胶体金颗粒，研制出快速、简便检测CSFV野毒的胶体金免疫层析试纸条，达到了区分检测CSFV野毒株和弱毒株的目的。

3　猪瘟胶体金免疫技术与其他检测方法的比较

3.1 猪瘟抗原检测

王向鹏等[23]系统比较了检测CSFV的6种方法，结果表明RT-qPCR、RT-LAMP和RT-PCR由于其灵敏性高，可作为首选检测方法，但操作时需要避免假阳性的出现；病毒分离虽然操作繁琐，但结果准确，是确诊猪瘟必不可少的检测方法；抗原捕捉ELISA和胶体金试纸条检测时间较短，但敏感性较低。张艳英等[24]应用RT-nPCR、荧光抗体法、胶体金免疫层析试纸条3种方法，分别对30份疑似猪瘟病料中的CSFV进行检测。结果RT-nPCR方法检出阳性样品11份，荧光抗体法13份，胶体金免疫层析试纸条8份；3种方法检测全为阳性8份，全为阴性17份。结果表明，RT-nPCR具有快速、敏感等优点，但需一定仪器设备及成熟的方法；荧光抗体法所需时间较短，但需要经验丰富人员判定结果，且存在假阳性结果，敏感性较差；胶体金免疫层析试纸条方法最大的优点就是简便快速，且适合基层的应用，不足之处就是敏感性较低。

3.2 猪瘟抗体检测

金颜辉等[25]用金标免疫层析技术检测30份猪瘟标准阳性血清和18份标准阴性血清，结果阳性、阴性符合率均为100%。同时采用GICA、间接ELISA、Dot-ELISA、IHA平行检测205份血清样品，间接ELISA阳性率86.8%、GICA阳性率85.4%、Dot-ELISA阳性率81.5%、IHA阳性率58.5%。向林远等[26]用GICA和ELISA平行检测猪血清抗体滴度，二者符合率为86.6%，用GICA检测猪瘟抗体滴度存在一定程度的漏检率及误诊率，只能初步筛查猪瘟抗体，GICA筛查阴性的猪血样应再用ELISA法复检以防漏检。邢东义等[27]对西藏林芝地区某县采集的92个疑似猪瘟样品应用胶体金免疫层析法与ELISA法检测猪瘟抗体和抗原，结果表明，猪瘟胶体金法抗原和抗体检测阳性符合率为100%，ELISA法检测的阳性符合率为95%以上。宋忠旭等[28]也进行了胶体金免疫层析试纸条与ELISA检测猪瘟抗体的比对试验。结果胶体金免疫层析试纸条检测猪瘟抗体阳性检出率94.69%，ELISA法检测猪瘟抗体合格率95.58%，两者符合率为99.07%。这两种方法操作方便、快速，适合于临床快速检测和疫病普查中高通量样品的筛查。

4　小结与展望

猪瘟的检测方法较多，主要包括病毒分离鉴定、分子生物学及血清学方法。各种检测方法均具有一定的优缺点和局限性，各实验室和广大养殖户可根据自身条件选择一种或多种方法联合应用[29]。胶体金免疫技术具有简便、快速、特异、灵敏等优点，特别适合广大基层兽医人员进行大批量样品检测和大面积动物疫病普查等应用，是当前猪瘟检测方法中简单、快速、敏感的免疫学检测技术之一，具有广阔的应用前景和巨大的发展潜力[30]。相信随着免疫学技术的不断发展、猪瘟病毒研究的不断深入及胶体金免疫技术的不断完善，相信猪瘟胶体金免疫技术将不断走向成熟，逐渐实现抗原抗体的多元、定量或半定量检测。

[1] 李娇，谢金文，唐娜，等. 猪瘟病毒常用实验室诊断方法概述[J]. 养猪，2013（3）：97-101.

[2] 陈剑阁. 胶体金免疫技术在猪瘟诊断上的应用进展[J]. 中国动物保健，2011，13（6）：14-15.

[3] 刘贺，于丹. 猪瘟检测技术的研究进展[J]. 畜禽业，2016（8）：12-15.

[4] 陈龙宾，王爱华，苏小庚，等. 猪瘟病毒胶体金免疫层析检测方法的建立及应用[J]. 中国兽医科学，2007，37（6）：496-499.

[5] 张长弓，黄印尧，郑海明，等. 猪瘟病毒抗原胶体金快速检测试纸的研究[J].福建畜牧兽医，2007，29（6）：1-3.

[6] 杨明，陈伯祥，孙晓林，等. 猪瘟胶体金快速诊断试纸条的研制[J]. 甘肃农业大学学报，2010，45（2）：34-37.

[7] 付连军，姜成，李沐森. 猪瘟快速诊断金标试纸条的研制及应用[J]. 畜牧兽医杂志，2011，30（3）：17-19.

[8] 张露露. 猪瘟病毒E0蛋白单克隆抗体的制备及其胶体金免疫层析检测方法的初步探索[D]. 南京：南京农业大学，2012.

[9] 李娇，王金良，沈志强. 猪瘟抗体的几种常用检测方法概 述[J]. 养猪，2013（6）：126-128.

[10] 孔繁德，黄印尧，赖清金，等. 斑点免疫金渗滤法检测猪瘟抗体的研究[J]. 中国动物检疫，2003（11）：31-33.

[11] 王荣，孔繁德，吴德峰，等. 斑点免疫金渗滤法同时检测猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征抗体的研究[J].生物技术通报，2009（1）：107-111.

[12] 陈善真，林礼锟，王志花，等. 利用多肽抗原建立同时检测CSFV和PRRSV抗体的胶体金免疫层析方法[J]. 动物医学进展，2014，35（11）：1-5.

[13] 王丽，李学伍，腾蔓，等. 猪瘟病毒C株Erns/E2嵌合基因表达蛋白单克隆抗体的制备及其生物学特性的鉴定[J]. 细胞与分子免疫学杂志，2009，25（12）：1126-1129.

[14] 尹梅. 猪瘟病毒抗体胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制及初步应用[D]. 南京：南京农业大学，2013.

[15] 刘畅，郑鸣，潘春梅. 胶体金免疫层析法在猪瘟强、弱毒抗体检测上的应用[J]. 河南农业大学学报，2005，39（4）：59-63.

[16] 郑鸣，金彦法，闫国庆. 利用胶体金免疫层析法检测猪瘟强、弱毒抗体方法的建立[J]. 郑州牧业工程高等专科学校学报，2006，26（2）：1-4.

[17] 王慧杰，宁豫昌. 猪瘟胶体金免疫层析快速诊断法的建立及应用[J]. 中国农学通报，2007，23（6）：61-64.

[18] 李华玮，郑鸣. 胶体金免疫层析法检测猪瘟（强弱毒区分）抗体研究[J]. 广东农业科学，2012，39（7）：130-132.

[19] 夏照和. 特异性识别猪瘟病毒野毒株的单克隆抗体制备[D].哈尔滨：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，2008.

[20] 王向鹏，孙元，杨增岐，等. 检测猪瘟病毒野毒株胶体金免疫层析方法的建立[J]. 中国预防兽医学报，2010，32（6）：441-445.

[21] 彭伍平，夏照和，侯强，等. 猪瘟病毒石门强毒株和兔化弱毒疫苗株E2蛋白糖基化位点差异分析[J]. 病毒学报，2007，24（5）：389-393.

[22] 王向鹏. 猪瘟病毒野毒胶体金免疫层析检测方法的建立[D].杨凌：西北农林科技大学，2010.

[23] 王向鹏，张兴娟，孙元，等. 六种检测猪瘟病毒方法的比较[J]. 微生物学报，2010，50（8）：1087-1093.

[24] 张艳英，高桂生，高光平，等. 猪瘟病毒3种检测方法的比较[J]. 中国畜牧兽医，2013，40（3）：205-209.

[25] 金颜辉，黄印尧，张长弓，等. 应用金免疫层析技术检测猪瘟抗体的研究[J].中国动物检疫，2004，21（5）：26-27.

[26] 向林远，杜国芹. 胶体金法与ELISA法检测猪瘟抗体结果对比分析[J]. 湖北畜牧兽医，2012（8）：4-5.

[27] 邢东义，王刚，格桑央珍，等. ELISA和胶体金法在猪瘟病毒检测中的应用[J]. 甘肃畜牧兽医，2014，44（7）：14-16.

[28] 宋忠旭，雷彬，李良华，等. 胶体金免疫层析试纸条与ELISA检测猪瘟抗体的比对试验[J]. 养殖与饲料，2015（10）：4-5.

[29] 罗丹丹，谢晶，李兴玉，等. 猪瘟胶体金快速诊断法的研究进展[J]. 四川畜牧兽医，2014，41（2）：39-41.

[30] 姜成，李沐森，付连军，等.猪瘟快速诊断金标试纸条的研制及应用[J].畜牧兽医杂志，2011，30（3）：17-19.