AKT/HIF/VEGF信号通路与p—NMDAR2B在难治性癫痫相关性FCD致痫灶中的作用及相关因素分析

张扬+方富+林元相

[摘要] 目的 研究AKT/HIF/VEGF信號通路与p-NMDAR2B在难治性癫痫相关性FCD致痫灶中的作用及相关因素分析，探讨两者在FCD致痫灶中的作用及相关因素分析。方法 该研究于2010年1月—2015年1月间方便选取在福建医科大学附属第一医院神经外科进行手术治疗的50例难治性癫痫患者，所有患者均经术后病理证实为FCD，将术后病灶脑组织进行研究分析，作为实验组；其中FCDⅠ型30例，FCDⅡ型20例。同时另外选取50例行减压或清创手术的脑外伤患者，将术中获取的和各种病变患者手术入路不可避免要切除的正常脑组织进行研究，纳入对照组。均利用免疫组织化学染色和Western blot方法检测上述脑组织中的p-AKT1/2/3（Thr308）、HIF-1、VEGF以及p-NMDAR2B（Tyr1336）的表达情况和蛋白水平。观察各型癫痫患者和正常脑组织p-AKT1/2/3（Thr308）、HIF-1、VEGF以及p-NMDAR2B（Tyr1336）的表达情况、免疫组化积分情况以及β-actin灰度比值情况。 结果 ①各型难治性癫痫相关性FCD致痫灶中AKT/HIF/VEGF信号通路发生不同程度激活表现，属异常现象。②Western blot：p-AKT1/2/3（Thr308）、HIF-1、VEGF以及p-NMDAR2B（Tyr1336）在FCDⅠ型病灶中表达水平分别为（0.619 3±0.078 4）、（0.779 2±0.039 1）、（0.752 8±0.099 4）以及（0.641 4±0.091 9）；在FCDⅡ型病灶中表达水平分别为（0.885 9±0.031 1）、（0.862 9±0.035 5）、（0.839 2±0.038 1）以及（0.908 8±0.037 3），均明显高于正常脑组织的（0.404 2±0.084 9）、（0.467 9±0.013 8）、（0.479 8±0.045 1）以及（0.349 2±0.090 7），差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 AKT/HIF/VEGF信号通路可能是通过调控NMDA受体活性参与了FCD相关难治性癫痫的发生发展。

[关键词] 局灶性皮质发育不良；难治性癫痫；机制；AKT/HIF/VEGF信号通路；NMDA受体

[中图分类号] R737 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）10（c）-0015-04

The Significance and Relativity Analysis of AKT/HIF/VEGF Signal Path and p-NMDAR2B in the Epileptogenic Zone of the Focal Cortical Dysplasias Relative Intractable Epilepsy

ZHANG Yang1， FANG Fu2， LIN Yuan-xiang2

1.Neurosurgical Department， Fujian Provincial Hospital， Fuzhou， Fujian Province， 350001 China； 2.Neurosurgical Department， the First Hospital Affiliated to the Fujian Medical University， Fuzhou， Fujian Province， 350005 China

[Abstract] Objective This paper tries to investigate the role and correlation of AKT / HIF / VEGF signaling pathway and p-NMDAR2B in refractory epilepsy-related FCD-induced epileptic foci， and to explore the role and correlation of AKT / HIF / VEGF signaling pathway in FCD-induced epileptic foci. Methods In this study， 50 patients with refractory epilepsy who underwent surgical treatment at the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University from January 2010 to January 2015. All patients were convenient confirmed to be FCD by postoperative pathology. The postoperative brain tissue was performed and analyzed， as the experimental group； of which 30 cases of FCD Ⅰ， 20 cases of FCD Ⅱ type. At the same time， 50 patients with brain injury undergoing decompression or debridement were selected. The normal brain tissue was removed from the control group. The p-AKT1/2/3 （Thr308）， HIF-1， VEGF and p-NMDAR2B （Tyr1336） in the brain tissue were detected by immunohistochemical staining and Western blot. The expressions of p-AKT1/2/3 （Thr308）， HIF-1， VEGF and p-NMDAR2B （Tyr1336） in the epilepsy and normal brain tissues were observed. The expressions of immunohistochemistry and β-actin gray ratio were observed. Results ①Various types of refractory epilepsy-related FCD-induced epilepsy in the AKT / HIF / VEGF signaling pathway to varying degrees of activation performance were abnormal phenomena. ②Western blot： The expression levels of PIF-AKTb 1/2/3 （Thr308）， HIF-1α， VEGF and p-NMDAR2B（Tyr1336） in FCD Ⅰ lesions were （0.619 3±0.078 4）， （0.779 2±0.039 1）， （0.752 8±0.099 4）， （0.641 4±0.091 9） respectively， and those in FCDⅡwere （0.885 9±0.031 1）， （0.862 9±0.035 5）， （0.8392±0.0381） and （0.908 8±0.037 3）， which were significantly higher than those in the control group of （0.404 2±0.084 9）， （0.467 9±0.013 8）， （0.479 8±0.045 1） and （0.349 2±0.090 7）， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The AKT / HIF / VEGF signaling pathway may be involved in the development of FCD-associated refractory epilepsy by regulating NMDA receptor activity.endprint

[Key words] Focal cortical dysplasia； Refractory epilepsy； Mechanism； AKT/HIF/VEGF signaling pathway； NMDA receptor

癫痫是临床儿科最常见疾病之一，虽然近年来抗癫痫药物不断出现，但仍然有部分患儿进展为难治性癫痫，给患儿带来极大危害。随着对难治性癫痫的不断深入研究，显示难治性癫痫与AKT/HIF/VEGF以及p-NMDAR2B等信号通路有密切关系。因此该文对福建医科大学附属第一医院神经外科2010年1月—2015年1月期间收治的50例难治性癫痫患者作为研究对象，探讨AKT/HIF/VEGF信号通路与p-NMDAR2B在难治性癫痫相关性FCD致痫灶中的作用及相关性分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

该研究方便选取在福建医科大学附属第一医院神经外科进行手术治疗的50例难治性癫痫患者，所有患者均经术后病理证实为FCD，将术后病灶脑组织蜡块进行研究分析，根据2011年国际抗癫痫联盟专家共识标准重新分类[1]，该次研究中实验组所有蜡块均行HE染色后分类评估，结果表明符合诊断为FCDⅠ型30例，FCDⅡ型20例。排除标准：不典型病变、存在FCD診断争议、血管畸形、脑软化灶、良性肿瘤、海马硬化等FCDⅢ型。

同时另外选取50例行减压或清创手术的脑外伤患者，将术中获取的和各种病变患者手术入路不可避免要切除的正常脑组织进行研究，纳入对照组。这些患者之前无惊厥史和其他神经病史，纳入标准：该次研究已取得患者及家属知情同意；取得福建医科大学生物医学研究伦理委员会批准，符合各项准则。

1.2 标本分组及石蜡切片制作

分实验组1（FCDⅠ型30例）、实验组2（FCDⅡ型20例）以及对照组（正常脑组织8例）。

1.2.1 取材、固定、标本切片 取得标本后，分成2个部分，一部分立即浸泡于10%福尔马林溶液中固定，固定时间>24 h，予石蜡包埋，逐步进行脑组织脱水透明浸蜡，切片备用。另一部分组织取出后放液氮保存1 h后移到-80℃冰箱保存，做好标记予Western blot备用。

1.2.2 结果判定 在神经元及胶质细胞中，观察p-AKT1/2/3（Thr308）、HIF-1、VEGF以及p-NMDAR2B（Tyr1336）表达结果显示免疫组化染色阳性结果为棕黄色或棕褐色颗粒[1]。

1.3 Western blot

经过以下步骤：采用组织裂解方法进行蛋白样本提取制备，采用BCA法蛋白定量，及 SDS-PAGE蛋白质电泳、转膜、封闭及杂交、曝光等步骤，最后进行结果判定。

1.4 统计方法

免疫组化得分和Western blot灰度值相关数据以均数±标准差（x±s）表示，使用GraphPad Prism统计学软件进行数据分析；采用SPSS统计学软件，根据数据特征独立样本t检验，结合方差齐性分析得出统计结果，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各指标在FCDⅠ型、Ⅱ型及正常脑组织中总体半定量分析、免疫组化积分得分情况表1、表2；各指标在FCDⅠ型和Ⅱ型免疫组化得分情况见表3；各组指标与 -actin灰度比值分析件表4；各指标在FCDⅠ型和Ⅱ型 -actin灰度比值分析见表5。

3 讨论

国内外对于FCD致痫机制的研究仍不十分明确，目前普遍认为是由于兴奋性与抑制性神经递质系统紊乱，亦可其受体损害所致[1-3]。

AKT/HIF/VEGF是一条经典的血管机制信号通路[4]，已有研究发现此信号通路不仅仅作用于血管内皮细胞，在中枢神经系统中，还可以直接作用于神经元和胶质细胞。PI3K是一种可使肌醇环上第3位羟基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶，PI3K活化后，其可使细胞膜上的肌醇磷酸化，磷酸化过程中产生的第二信使结合AKT及下游信号通路；AKT在Thr308磷酸化后被活化为p-AKT，直接或间接调节多种转录因子的表达及影响凋亡蛋白活性的表达[5-6]。

该实验针对难治性癫痫相关性FCD致痫灶中p-AKT1/2/3（Thr308）、HIF-1、VEGF以及p-NMDAR2B（Tyr1336）的表达情况和蛋白水平，检测FCD致痫灶中是否存在上述各指标的差异表达，AKT/HIF/VEGF信号通路是否异常激活，VEGF与p-NMDAR2B在FCD相关性难治性癫痫的发生发展中是否存在一定的因果关系。我们实验结果显示，p-AKT1/2/3（Thr308）、HIF-1、VEGF以及p-NMDAR2B（Tyr1336）在FCDⅠ型病灶中表达水平分别为（0.619 3±0.078 4）、（0.779 2±0.039 1）、（0.752 8±0.099 4）以及（0.641 4±0.091 9）；在FCDⅡ型病灶中表达水平分别为（0.885 9±0.031 1）、（0.862 9±0.035 5）、（0.839 2±0.038 1）以及（0.908 8±0.037 3），均明显高于正常脑组织的（0.404 2±0.084 9）、（0.467 9±0.013 8）、（0.479 8±0.045 1）以及（0.349 2±0.090 7），差异有统计学意义（P<0.05），也进一步证实了目前的研究观点。

在中枢神经系统，p-AKT对神经元和胶质细胞均起到一定的影响作用，主要表现在细胞的增值，分化迁徙以及细胞的存活；在FCD相关的难治性癫痫发作期间，存在有皮层神经元缺血缺氧，这种病灶微环境能够通过激活PI3K/AKT信号通路，诱导AKT磷酸化，进而促进HIF-1蛋白表达；而HIF-1在胞浆中表达增高趋势，逐渐转移至核内；进而推测在FCD中存在有p-AKT介导HIF/VEGF信号通路的激活。然而诱导VEGF表达的分子机制可能是HIF-1[7]，在缺氧环境下，作为一种核转录因子，能够上调VEGF的转录翻译；尤其是在癫痫长时间发作比如癫痫持续状态，缺氧对于诱导VEGF表达是一个重要的扳机点[8]。其他的转录因子如AP-1、NF-κB以及炎症因子IL-1β证明也存在有上调VEGF表达的作用。endprint

该研究发现在FCD中AKT/HIF/VEGF信号通路异常激活，且诱导表达的VEGF和p-NMDAR2B上调与FCD相关性难治性癫痫有关，若以两者为切入點，可能为癫痫的临床治疗提供更为广阔的应用前景，为抗癫痫寻求新的治疗靶点，对抗癫痫新药的研制提供新的思路。

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（收稿日期：2017-07-22）endprint