预适应联合后适应对大鼠缺血再灌注损伤的保护作用

张涛+许文胜+郝冬梅+何宏伟+单新亮+李鑫瑶+孙旭+高彩凤

[摘要] 目的 探討预适应联合后适应对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法 该实验于2015年10月—2016年9月进行。选取清洁级雄性SD大鼠50只，体重（270±30）g（内蒙古科技大学包头医学院动物中心提供，合格证号：201407413，ddY系SPF级）；随机分为假手术组、模型组、预适应组、后适应组和预适应+后适应组，每组10只，除假手术组外，其余各组大鼠均制作为脑缺血/再灌注损伤模型，在再灌注48 h后，检测各组大鼠神经功能、脑梗死灶体检、脑组织氧化应激损伤生化指标及神经元凋亡情况。结果 再灌注12、24 h和48 h模型组神经功能缺陷评分（3.10±0.23）分、（3.53±0.15）分、（3.32±0.16）分明显高于其他处理组（P<0.05）；再灌注12、24 h和48 h处理组中，预适应+后适应组神经功能缺陷评分最低（1.89±0.11）分、（1.75±0.12）分、（1.22±0.13）分（P<0.05）；预适应+后适应组脑梗死灶体积为（100.41±33.26）mm3，明显低于模型组、预适应组和后适应组（P<0.05）；预适应组（182.43±50.10）mm3和后适应组（185.10±52.33）mm3脑梗死灶体积较模型组（100.41±33.26）mm3降低（P<0.05）；假手术组超氧化物歧化酶（SOD）活性（122.41±24.61）μn/mgprot明显高于模型组（45.56±10.31）μn/mgprot，而丙二醛（MDA）（43.51±9.64）nmol/mgprot低于模型组（113.43±21.07）nmol/mgprot（P<0.05）；后适应组（76.81±9.83）μn/mgprot和预适应后适应组SOD活性较模型组升高（110.13±12.16）μn/mgprot，而MDA（61.51±12.15）nmol/mgprot较模型组（113.43±21.07）nmol/mgprot降低（P<0.05）；假手术组细胞凋亡数（15.20±7.62）个明显低于模型组（84.11±8.42）个（P<0.05）；各处理组细胞凋亡数较模型组有所降低（73.04±9.01）个、（61.12±10.17）个（P<0.05），其中预适应+后适应组神经元细胞凋亡数最少，为（47.20±9.21）个。结论 预适应和后适应均能对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用，而两者联合应用能进一步加强保护作用。

[关键词] 脑缺血再灌注损伤；预适应；后适应；大鼠

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）10（c）-0006-05

Protective Effects of Preconditioning Combined with Post Adaptation on Cerebral Ischemia and Reperfusion Injury in Rats

ZHANG Tao， XU Wen-sheng， HAO Dong-mei， HE Hong-wei， SHAN Xin-liang， LI Xin-yao， SUN Xun， GAO Cai-feng

Research Room of Immunology， School of Basic Medical and Forensic Medicine， Baotou Medical College， Baotou， Inner Mongolia， 014040 China

[Abstract] Objective This paper tries to investigate protective effects of preconditioning combined with post adaptation on cerebral ischemia and reperfusion injury in rats. Methods The experiment was implemented from October 2015 to September 2016. 50 clean grade male SD rats were selected weight for （270±30）g （provided by Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou Medical College Animal Center， certificate number： 201407413， ddY department， SPF grade）， the rats were randomly divided into sham operation group， model group， pre-adaptation group， post adaptation group and preconditioning + post adaptation group， with 10 rats in each group， except sham operation group， other groups were made into cerebral ischemia / reperfusion injury model， after 48h of reperfusion， each groups rat neurological function was detected， cerebral infarction， brain tissue oxidative stress injury biochemical indicators and neuronal apoptosis in rats were observed. Results Reperfusion for 12， 24 h and 48 h， the model group of nerve function defect score was（3.10±0.23）points，（3.53±0.15）points，（3.32±0.16）points， significantly higher than that of other groups（P<0.05）； Reperfusion for 12， 24 h and 48 h， preconditioning + post adaptation group neural function defect score was （1.89±0.11）points，（1.75±0.12）points， （1.22±0.13）points， （P<0.05）； the preconditioning group + postconditioning group was（100.41±33.26）mm3， which was significantly lower than that in the model group， and the preconditioning group and the postconditioning group （P<0.05）. The pretreatment group was （182.43±50.10）mm3 and the postconditioning group was （185.10±52.33）mm3 and the model group was （100.41±33.26）mm3 （P<0.05）. The activity of superoxide dismutase （SOD） was （122.41±24.61）μn/mgprot in sham operation group， significantly higher than that in model group of（45.56±10.31）μn/mgprot， while that of malondialdehyde （MDA） was （43.51±9.64）nmol/mgprot， significantly lower than that in model group of（113.43±21.07）nmol/mgprot（P<0.05）， the post adaptation group was （76.81±9.83）nmol/mgprot， and the preconditional group±The activity of SOD in the postconditioning group was（110.13±12.16）μn/mgprot， MDA was（61.51±12.15）nmol/mgprot， lower than the model group of （113.43±21.07）nmol/mgprot，（P<0.05）； The number of apoptotic cells in sham operation group was （15.20±7.62）， significantly lower than that in model group of （84.11±8.42） （P<0.05）. The number of apoptotic cells in each treatment group was significantly lower than that in model group of （73.04±9.01），（61.12±10.17）（P<0.05）， and the number of neurons in the pretreatment group was the lowest of （47.20±9.21）. Conclusion Preconditioning and post adaptation can protect the cerebral ischemia / reperfusion injury in rats， and the combined application of the two methods can further strengthen the protective effect.endprint

[Key words] Cerebral ischemia reperfusion injury； Preconditioning； Post adaptation； Rat

脑缺血再灌注损伤主要是指恢复缺血脑组织的血流灌注对脑组织造成的严重损伤，其可引起一系列的细胞和生理反应，如产生大量氧自由基等活性分子、诱导前列腺素合成、诱导活化信号分子和诱导炎症因子产生等，导致线粒体功能障碍等，严重影响患者的生活质量[1-2]。而缺血预适应主要是指短暂缺血再灌可增强脑组织对随后较长时间缺血损伤的耐受性的现象，缺血后适应主要是指在脑缺血后再灌早期采用反复数次短暂缺血再灌可保护脑组织以防止再灌注损伤，二者均可调动细胞内源性保护机制，进而抵抗神经细胞损伤，但具体作用机制目前尚不完全清楚[3-4]。为了进一步讨预适应联合后适应对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用，该研究于2015年10月—2016年9月将50只SD大鼠[内蒙古科技大学包头医学院动物中心提供，合格证号：201407413，ddY系SPF级，（270±30）g]，制作脑缺血/再灌注损伤模型后的神经功能、脑梗死灶体检、脑组织氧化应激损伤生化指标及神经元凋亡情况进行了检测分析，并与正常大鼠进行了比较，为临床上提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

该实验于2015年10月—2016年9月进行。选取清洁级雄性SD大鼠50只，体质量240～300 g，均由内蒙古科技大学包头医学院动物中心提供，合格证号：201407413，ddY系SPF级。将大鼠随机分为5组，每组10只：假手术组（仅分离大鼠颈部血管，不插线栓）、模型组（线栓法行大脑中动脉阻闭120 min后再灌注）、预适应组（在造模前24 h和1 h行3个循环的缺血15 s+再灌注30 s）、后适应组（在造模后行3个循环的再灌注30 s+缺血15 s）和预适应+后适应组（在造模前24 h和1 h行3个循环的缺血15 s再灌注30 s以及在造模后行3个循环的再灌注30 s+缺血15 s）。

1.2 仪器与试剂

精密电子天平（DV215CD）购自日本奥豪斯公司；高速离心机（CRII）购自日本日立公司；数码相机（A-550）购自日本SONY公司，彩色病理图文分析系统（HPIAS-1000）购自武汉千屏影像公司，紫外分光光度计（UV-2550）购自日本岛津仪器公司，显微镜（Ls-210）购自日本奥林巴斯公司。丙二醛（MDA）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒和考马斯亮兰蛋白测定试剂盒购自北京中金杉生物技术有限公司；TUNEL试剂盒购自德国Roche公司；氯化三苯基四氮唑（TTC）购自美国Sigma公司。

1.3 模型制备

所有实验大鼠在术前均禁食12 h，自由饮水，随后行大脑中动脉阻闭120 min后再灌注造成局灶性脑缺血再灌注损伤模型，具体造模方法如下：腹腔注射10%水合氯醛麻醉后颈部备皮、消毒，在颈正中做长约1.5 cm切口，分离右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，结扎颈外动脉远心端及颈内动脉的颅外分支翼腭突动脉。利用动脉夹夹闭颈总动脉近心端和颈内动脉远心端，防止血液返流，随后在颈外动脉近分叉处剪一切口，经颈外动脉将线栓插入颈内动脉，松开颈内动脉远心端的动脉夹后继续插入线栓，直至到达大脑前动脉近端壁，阻断大脑中动脉来自颈内动脉、大脑前动脉及大脑后动脉的所有血供。去除颈总动脉上的动脉夹，依次缝合肌肉和皮肤切口，但将线栓外留。阻断120 min后再次麻醉动物，将线栓缓慢拔出，恢复血流再灌注。假手术组仅分离颈内动脉和颈外动脉，不插线栓。

1.4 预适应与后适应处理

预适应方法：预适应组大鼠和预适应+后适应组大鼠在造模前24 h和1 h分别行3个循环的大脑中动脉缺血15 s+再灌注30 s作为预适应，即阻断大脑中动脉15 s后拔出線栓再灌注30 s，重复3个循环。后适应方法：后适应组和预适应+后适应组大鼠在造模后拔出线栓再灌注30 s，然后将线栓再次插入颈内动脉阻闭大脑中动脉15 s，重复3个循环后进行持续再灌注48 h。

1.5 脑梗死灶测定

各组于造模48 h后随机取4只处死后断头取脑，除去嗅球、小脑和低位脑干部分后切成约2 mm厚脑片，迅速放入氯化三苯基四氮唑溶液（TTC）中37℃染色30 min，正常组织可被TTC染为深红色，而缺血坏死的脑组织不与TTC反应，应为白色。将切片多聚甲醛固定后放置比例尺并拍照，利用图像处理软件描绘出每一层面染色成白色的区域后，按比例求出各脑片的梗死面积（红色区域为正常脑组织，白色区域为梗死区）。

1.6 脑组织匀浆生化指标测定

各组再随机取4只大鼠断头后取脑，去除小脑和嗅球后用冷生理盐水漂洗，滤纸拭干后称重，随后加入等体积预冷的生理盐水后利用匀浆机制成匀浆，高速离心机以6 000 r/min离心15 min后取上清液，于冰箱保存待测。

取少量上清液分别加入考马斯亮兰蛋白测定试剂盒、SOD试剂盒和MDA试剂盒进行处理，并利用紫外分光光度计分别在590、550 nm和532 nm处测定吸光度，根据公式求出样本中蛋白质浓度、SOD活性和脂质过氧化产物MDA的含量，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.7 细胞凋亡测定

将各组剩余的大鼠麻醉后先经心脏灌注生理盐水，把血液冲净后再用4%多聚甲醛灌注，随后断头取脑，将缺血侧脑组织用4%多聚甲醛进行固定。常规脱水和石蜡包埋处理，在视交叉后1 mm处及4 mm处行冠状切片后做连续切片，厚约5 μm。将相邻大脑切片用TUNEL试剂盒进行染色后于显微镜下观察并记录实验结果。阳性细胞结果应为棕黄色（核）或棕褐色，背景呈蓝紫色，每张切片在普通光镜镜下随机釆集5个不重叠视野进行观察，记录每个视野中的调亡细胞个数，取平均值作为调亡细胞数。endprint

1.8 神经功能缺陷评分

采用Longa等描述的5级神经缺陷评分法对大鼠手术后再灌注6、12、24 h和48 h神经功能进行评分：0级为无神经功能缺陷，记为0分；Ⅰ级为不能完全伸展缺血病灶对侧前肢，记为1分；Ⅱ级为行走时向缺血病灶对侧转圈，记为2分；Ⅲ级为行走时向缺血病灶对侧倾倒，记为3分；Ⅳ级为不能自发行走，昏迷，记为4分。

1.9 统计方法

数据整理分析采用SPSS 19.0统计学软件，计量资料采用（x±s）表示，组间比较使用方差检验，两两比较采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较

再灌注后6 h各处理组与模型组神经功能缺陷评分差异无统计学意义（P>0.05）；再灌注12、24 h和48 h模型组神经功能缺陷评分明显高于其他处理组（P<0.05）；再灌注12、24和48 h处理组中，预适应+后适应组神经功能缺陷评分最低（P<0.05），而预适应组和后适应组神经功能缺失评分比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠脑梗死灶体积比较

预适应+后适应组脑梗死灶体积为（100.41±33.26）mm3，明显低于模型组、预适应组和后适应组（P<0.05）；预适应组和后适应组脑梗死灶体积较模型组降低（P<0.05）；预适应组和后适应组脑梗死灶体积比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠脑组织SOD和MDA比较

假手术组SOD活性明显高于模型组，而MDA低于模型组（P<0.05）；模型组与预适应组SOD和MDA比较差异无统计学意义（P>0.05）；后适应组和预适应+后适应组SOD活性较模型组升高，而MDA较模型组降低（P<0.05）。见表3。

2.4 各组皮质神经元凋亡影响

假手术组细胞凋亡数明显低于模型组（P<0.05）；各处理组细胞凋亡数较模型组有所降低（P<0.05），其中预适应+后适应组神经元细胞凋亡数最少，为（47.20±9.21）个。见表4、图1。

3 讨论

脑是人体对缺血最为敏感的器官，脑组织缺血将会导致局部脑组织及其功能的损害，即使短暂的缺血也可导致神经元的损伤或死亡，而长时间的完全缺血或严重缺血会引起梗死[5]。缺血后血流恢复无疑是维持和防止脑组织进一步损伤的必需措施，但再灌注后往往发生复杂的脑循环机能和代谢的变化，加重缺血后的脑组织损伤，常表现于围术期脑外伤及头颈部大血管手术[6]。脑缺血时脑细胞生物电会发生改变，并出现病理性慢波，缺血一定时间后再灌注，慢波持续并加重，而颞叶组织内神经递质性氨基酸代谢也会发生明显变化，即兴奋性氨基酸随缺血-再灌注时间延长而逐渐降低，抑制性氨基酸在缺血-再灌注早期明显升高。缺血再灌注损伤时间越长，兴奋性递质含量越低，脑组织超微结构改变越明显，但其具体机制目前尚不完全清楚[7-8]。

该研究将SD大鼠制作脑缺血/再灌注损伤模型后的神经功能、脑梗死灶体检、脑组织氧化应激损伤生化指标及神经元凋亡情况进行了检测分析，并与正常大鼠进行了比较，为临床上提供了理论依据。研究结果表明，再灌注12、24 h和48 h模型组神经功能缺陷评分明显高于其他处理组，再灌注12、24 h和48 h处理组中，预适应+后适应组神经功能缺陷评分最低，而预适应组和后适应组神经功能缺失评分比较差异无统计学意义，提示预适应+后适应可明显改善脑缺血/再灌注损伤导致的神经功能下降程度，且比单独预适应或后适应的效果更好。同时发现，假手术组SOD活性明显高于模型组，而MDA低于模型组；模型组与预适应组SOD和MDA比较差异无统计学意义；后适应组和预适应+后适应组SOD活性较模型组升高，而MDA较模型组降低。SOD可清除超氧阴离子，其活性的下降则意味着机体抗氧化能力的降低；而MDA的含量变化可间接反映脑组织中ROS含量的变化和脑组织的损伤程度，而后适应可明显上调SOD水平并降低MDA水平，进而抑制ROS的爆发，其抗氧化作用较强。研究还发现，各处理组细胞凋亡数较模型组有所降低，其中预适应+后适应组神经元细胞凋亡数最少，而预适应+后适应组脑梗死灶体积明显低于模型组、预适应组和后适应组，预适应组和后适应组脑梗死灶体积较模型组也明显降低，提示预适应和后适应均可明显改善脑组织的损伤程度，进而抑制再灌注期的氧化应激损伤，从而减少神经细胞的调亡与坏死，但联合后的保护效果更好。但该研究限于研究样本的不足，对于预适应联合后适应对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用的具体机制仍需作进一步的深入研究。

综上所述，预适应和后适应均能对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用，而两者联合应用能进一步加强保护作用。

[参考文献]

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（收稿日期：2017-07-22）endprint