ELISA法和RT—PCR法在麻疹病毒检测中的应用对比

廖秀海

【摘要】 目的：对比分析酶联免疫吸附试验（ELISA）法和实时荧光定量PCR（RT-PCR）法在麻疹病毒检测中的应用。方法：由本市各医院采集并送至本中心接受麻疹病毒检测的50例疑似麻疹患者为研究对象，所有患者标本均采用ELISA法和RT-PCR法进行麻疹病毒检测。对比两种检测方式在不同出疹时间段所取标本的阳性率、检测水平。结果：在50例疑似麻疹患者中，ELISA法检测麻疹病毒IgM抗体阳性22例，IgM抗体阴性28例，阳性率为44.00%；RT-PCR法检测，麻疹病毒IgM抗体阳性26例，IgM抗体阴性24例，阳性率为52.00%，两种检测方式阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。患者出疹第1天收集的标本，采用ELISA法检测阳性率为60.00%，采用RT-PCR法检测阳性率为80.00%。随着患者采样时间不断改变，两种检测方式的阳性率均逐渐降低，两种方法检测的阳性率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。50例麻疹疑似患者同一时间段采集血清和咽拭子标本，24例患有免疫史，不伴随有免疫史亦或者是不详的共26例。结论：RT-PCR法适用于出疹时间在2 d之内疑似麻疹患者的临床诊断中，而ELISA法则适合使用在出疹时间在2 d或以上疑似麻疹患者的临床检测中。

【关键词】 酶联免疫吸附试验法； 实时荧光定量PCR法； 麻疹病毒

【Abstract】 Objective：To observe and compare the application of enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） and real-time fluorescence quantitative PCR（RT-PCR） in the detection of measles virus.Method：Fifty patients collected from hospitals in our city and sent to our center for measles virus test were selected as research objects，all patients were tested for measles virus by ELISA and RT-PCR.Compared the positive rate and the level of the specimens taken by the two methods at different rash time.Result：A total of 22 cases of measles were positive for measles virus and 28 cases were negative for measles virus，the positive rate was 44.00%.In total，26 cases of measles virus IgM antibody，24 cases of negative measles virus IgM antibody，the positive rate was 52.00%.There was no significant difference in the positive rate of the two detection methods（P>0.05）.When the samples were collected on the first day of the test by ELISA，the positive rate was 60.00%，when the specimens collected on the first day of the test were detected by RT-PCR，the positive rate was 80.00%.With the continuous change of sampling time，the positive rates of the two test methods decreased gradually，there were no significant differences in the positive rate of the two methods（P>0.05）.Serum and throat swab samples were collected in the same period of 50 suspected cases of measles，24 cases had a history of immunization，without a history of immunization or an unknown total of 26 cases.Conclusion：The RT-PCR method is suitable for the clinical diagnosis of measles patients with measles within two days，while the ELISA method is suitable for the clinical test of patients with suspected measles two or more days.

【Key words】 ELISA； RT-PCR； Measles virus

First-authors address：Xinyu City Center for Disease Control and Prevention，Xinyu 338000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.36.026

麻疹病毒属于麻疹的病原体，一旦不小心感染这种病原体就会有很大的可能诱发以发热、出疹为主要症状表现的急性病毒性呼吸道传染病，该病的发病率非常高，具有极强的传染性。目前，麻疹病毒已經被归纳进我国计划免疫病毒之一[1-2]。由于麻疹病毒的感染速度非常快，所以初期给予疑似麻疹患者实施有效的诊断是至关重要的，并且一旦确诊就必须要立即选用相应的防治措施进行预防，从而有效降低麻疹暴发率[3]。本文通过探究酶联免疫吸附试验（ELISA）法和实时荧光定量PCR（RT-PCR）法在麻疹病毒检测中的应用，得出如下结论。endprint

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机抽取2015年1月-2016年12月由新余市疾病预防控制中心进行麻疹病毒检测的50例疑似麻疹患者为研究对象，所有患者均采用ELISA法和RT-PCR法进行麻疹病毒检测。其中，男35例，女15例；年龄6～14岁，平均（9.28±1.26）岁。于患者出疹时间14 d内抽取血标本，采用ELISA法检测血清中麻疹特异性IgM抗体；患者出疹第5天后，采集咽拭子标本，采用RT-PCR法检测麻疹病毒的核酸。此外，使用ELISA法和RT-PCR法共同检测标本中存在的风疹病毒，利用这两种检测方式排除风疹病毒，以免其对检测结果产生不良的影响[4]。

1.2 仪器与试剂 安图-2010酶标仪；ABI7300荧光定量PCR仪；麻疹病毒IgM抗体检测试剂盒（生产商家：珠海经济特区海泰生物制药有限公司，产品编号：YZB/国6817-2012）；RNA提取试剂盒：QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit试剂盒（Cat∶74106）；荧光RT-PCR试剂盒：广州达安基因公司的流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法，Cat：#DA-BN238）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 抽取全部患者静脉血，每例患者抽取的血量均为2～3 mL，然后将收集的静脉血送至实验室实施离心措施，离心时间最好保持在20 min左右，离心结束后选取上层血清，将其放置于2～8 ℃的环境下冷藏备用。同时选取病毒采样管拭子头于患者咽喉位置进行擦拭，以收集该位置的上皮细胞，最后将拭子头放置进采样液之中，将标本放置于2～8 ℃的环境下进行冷藏备用[5-6]。

1.3.2 ELISA法检测血清中麻疹IgM 在给予患者的血液样本实施麻疹病毒IgM抗体检测时，在操作试剂盒的过程中可以根据说明书上所写的操作操作步骤来实施，并且在专门设定一个空白对照孔，同时对其添加任何一种液体；再然后分别于阴性、阳性两个位置设定2个对照孔，接下来再根据100 μL/孔使用相应的对照液添加进阴性、阳性；而在样品孔方面，可以结合100 μL/孔，再使用10 μL待测血清、标本稀释液两种不同类型的液体依次加入。此外，为了能够降低风疹病毒所造成的干扰，在进行检测的过程中使用风疹病毒IgM抗体检测试剂盒对全部患者的血清样本实施风疹病毒IgM检测。

1.3.3 RT-PCR法检测病毒核酸 首先对全部的患者实施咽拭子收集，可以使用消毒过后的无菌棉签浸湿患者咽部位置少量的分泌物，收集人员在采集的过程中最好尽量避开患者的口腔内部的黏膜、唾液、舌头等组织和液体[7]。采集成功之后将其放置进容量为3～5 mL的病毒标本保存液进行贮存，于标本袋的顶端位置将棉签折断，再使用柱式病毒RNAout试剂盒提取RNA，使用于后续的扩增措施。其次再对患者进行RT-PCR法检测，在进行检测的过程中检测人员可以结合麻疹病毒RNA检测试剂盒所提供的说明书上的具体操作步骤实施检测，进行安置反应体系成功之后，在PCR仪实施扩增措施，具体的反应条件包含有以下几点：（1）逆转录：温度为50 ℃，时间为15 min，循环次数为1个；（2）预变性：温度为95 ℃，时间为15 min，循环次数为1个；（3）退火、变性、延伸：温度为94 ℃，时间为15 s，循环次数为40个；（4）当温度为55 ℃，开始对全部的荧光信号进行收集[8]。

1.4 实验室患者确诊定义 结合中国麻疹、风疹网络实验室指定的相关标准进行操作，疑似患者中麻疹特异性IgM抗体检测阳性、麻疹核酸RNA阳性、特异性IgM抗体、核酸RNA均为阳性，即能够将其诊断为实验室患者确诊[9]。

1.5 统计学处理 采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种检测方式的检出阳性情况 50例疑似麻疹患者同一时间段采集血清、咽拭子标本进行检测，使用ELISA法进行检测，总共有22例麻疹病毒IgM抗体阳性，28例麻疹病毒IgM抗体阴性，阳性率为44.00%；而使用RT-PCR法进行检测，总共有26例麻疹病毒IgM抗体阳性，24例麻疹病毒IgM抗体阴性，阳性率为52.00%。两种检测方式的阳性率比较，差异无统计学意义（ 字2=0.93，P>0.05）。见表1。

2.2 不同时间段收集的标本两种检测方式检测结果比较 本研究是通过患者的出疹时间为标准而设定其实施采样时间，将患者出疹第1天設定采集时间为0 d，采用ELISA法检测阳性率为60.00%，采用RT-PCR法检测阳性率为80.00%。随着患者采样时间不断改变，两种检测方式的阳性率均逐渐降低，两种方法检测的阳性率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3 不同免疫史标本的检测情况 50例麻疹疑似患者同一时间段采集血清和咽拭子标本，24例患有免疫史，不伴随有免疫史或是不详的共26例。

3 讨论

作为出疹类可传染疾病的一种，麻疹在出现疹子的前后5 d都会带有比较强烈的传染性，值得注意的是，麻疹病毒的携带者及隐形感染者比较少见，麻疹病毒一般从患者呼吸道分泌物或血液中分离出，所以在医学上更重视对患者的早期诊断、观察与隔离[10-11]。经过医学发展及研究人员的努力，现如今ELISA法与RT-PCR法是常用的针对麻疹的实验室诊断方法。这两种检测方式均具有快速、灵敏以及易操作等优点[12-13]。本研究应用ELISA法和RT-PCR法同一时间段采集50例疑似麻疹患者的血清、咽拭子两种标本，ELISA法和RT-PCR法对患者标本核酸进行检测，两种检测方法的阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。但是RT-PCR法比ELISA性多检出5例，说明荧光PCR法灵敏度稍高于ELISA。endprint

文献[14-16]研究表明，荧光PCR的敏感度高于血清ELISA。荧光PCR可以在发热仅1 d的小儿样本中检测出麻疹病毒，而且还可通过荧光PCR法对于一些血清IgM抗体呈阴性的患者进行进一步检测，从而尽力实现无漏检的目的。另有研究结果显示采血时间的不同也会对实验结果造成颇大的影响。欧阳霖等[17]对不同采血时间进行研究显示，出疹后第1～3天ELISA法检测麻疹病毒特异性IgM抗体阳性率在30.70%～44.70%，至出疹后第8天达到87.10%。而在本研究中，出疹后当天ELISA法检测麻疹病毒特异性IgM抗体阳性率在60.00%，出疹8 d后ELISA法检测麻疹病毒特异性IgM抗体阳性率在33.33%，经分析，这可能与采样数量及病例的个体差异导致体内抗体水平差异有关。

因实时荧光定量PCR技术具有灵敏度及准确度高、快速及操作简单等一系列优点，在处置麻疹疫情过程中，大概在几个小时内即可得到实验室确诊[18]。与传统PCR检测方法相比，实时荧光定量PCR快速检测麻疹病毒核酸克服了假阳性、灵敏度不高等诸多问题，且其操作方法更简单便捷，不用经过PCR后处理，结果直观，避免了人为判断，从核酸提取至完成检测整个过程仅需3 h左右。但在实际操作中，进行实时荧光定量PCR实验所需要的仪器较为昂贵，试剂耗材等相关费用也较高，且实验室生物安全要求也相对较高，并未在县（区）级医院和县疾控中心全部配备完成[19-20]。所以从实际考虑，对于边远地区而言，ELISA法检测显然更适合用来确诊病例。

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（收稿日期：2017-12-06） （本文编辑：张爽）endprint