ECDI修饰的自身肽在自身免疫病中的研究进展①

朱漫漫 余玉明 刘艳君

(南方医科大学基础医学院免疫学教研室,广州 510515)

正常情况下，机体识别自身组织成分不对其产生免疫应答，或仅产生轻微的免疫应答，此为免疫耐受。在某些异常情况下(如病毒感染、体细胞基因突变)，自身耐受遭到破坏，导致机体免疫系统对自身抗原产生免疫应答，诱生自身抗体和(或)自身致敏淋巴细胞，此即自身免疫。若自身免疫应答过强或持续时间过久，以致对表达自身靶抗原的细胞和组织发动攻击，导致损伤或功能障碍并出现相应临床症状时，就称为自身免疫病。到目前为止，自身免疫病已成为第三大引起人类死亡的主要疾病[1]。自身免疫病的传统治疗方案主要是免疫抑制疗法，其虽有利于缓解免疫细胞对自身组织的损伤，但仍存在着较多的副作用(如机会致病菌的感染以及恶性肿瘤等)，更重要的是对于大多数患者而言，它的临床治疗效果并不显著[2,3]。因此，在最近的几十年，越来越多的研究者将目光转向于针对自身抗原、过敏原特异性的免疫耐受诱导方案，而ECDI修饰的同基因型脾细胞偶联抗原(Ag-SPs)诱导的免疫耐受是近几年出现的极具前景的诱导耐受方案。

1 自身免疫病的传统治疗方案

1.1免疫抑制疗法

1.1.1非特异性免疫抑制疗法 主要是指广谱的免疫抑制剂，曾是治疗自身免疫病最主要的方法。非特异性免疫抑制剂通过删除或灭活全部的T/B淋巴细胞亚群，选择性地抑制抗原的递呈、促炎性细胞因子的产生以及淋巴细胞的迁移，从而从整体上控制了自身淋巴细胞对自身抗原的免疫应答[4,5]。但其非特异性抑制作用可导致机体免疫功能低下，从而使机会致病菌感染的风险增加。另外，非特异性免疫抑制剂对机体具有潜在的毒性作用[6]。

1.1.2特异性免疫抑制疗法 (1)特异性抑制T细胞疗法：现普遍认为绝大多数自身免疫病是由于免疫耐受遭到破坏，免疫调节能力和抗原自身反应之间失衡，导致自身的T淋巴细胞，尤其是CD4+T细胞对自身抗原发生免疫应答，从而破坏自身正常组织结构并引起相应临床症状[7]。因此特异性地阻断自身反应性T细胞的应答，被认为是最有希望诱导抗原特异性耐受的方法。传统的特异性抑制T细胞疗法包括：溶解性肽疗法、变构肽、共刺激阻断、CD3抗体等[1,8]，然而这些方法大部分不能成功，或者只对部分患者有效。(2)特异性抑制B细胞疗法：在非肥胖型糖尿病(Non-obese diabetic ，NOD)动物模型以及人类Ⅰ型糖尿病(T1D)的发病机理中，B细胞最开始并不被认为是一个关键的致病因素[9]。直到有研究者在NOD小鼠中发现它的消融作用(Ablation)以及对自身抗原的递呈作用而最终被证实[10,11]。后来，Luan等[12]将NOD小鼠血清中带有致病性的自身抗体收集纯化后作为抗原免疫BALB/c小鼠，再将免疫后产生的抗体注射到NOD小鼠体内，他们发现这种抗体可杀伤与自身抗体分泌、递呈相关的B细胞系，从而减轻胰岛炎症状，最终延缓NOD小鼠糖尿病的发生[12]。

1.2替代疗法 有些自身免疫介导的损伤具有器官特异性，如T1D是由于自身反应性免疫细胞集聚并选择性地破坏胰腺β细胞[13]，因此这些自身免疫病可通过修复或替代损害的细胞或组织进行治疗，这种治疗方法就称为替代疗法。替代疗法，尤其是激素替代疗法，对早期某些自身免疫病(如T1D、甲状腺炎等)具有显著的疗效[1]。以T1D为例，其传统的治疗方案主要以胰岛素替代治疗为主。但这种治疗方法需要反复皮下注射，并且会出现酮症酸中毒、低血糖反应以及多器官衰竭等严重并发症[11]。

1.3其他 (1)抗原肽的直接递呈：最早在1920年Sulzberger[14]就提出并证实：以静脉注射的方式将抗原肽直接传递给宿主，能够在宿主体内诱导出抗原特异性的T细胞无能。后来Chiller等[15]同样证实溶解性抗原蛋白的直接呈递可有效地诱导宿主外周T细胞耐受[3]。然而，致命性致敏的发生限制了其实际的临床应用[16]。(2)造血干细胞移植：是重建正常造血和免疫功能的一种有效手段，主要用于治疗多种血液系统相关疾病[17]。近年来有研究者将其用于复发-缓解型多发性硬化症(RRMS)的治疗，但临床研究表明：自体造血干细胞移植(aHSCT)效果并不显著，并且难以获得足够数量的、稳定的、特异性的干细胞[8]。

2 ECDI在自身免疫病中的应用

ECDI即1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺[1-ethyl-3-(3′-dimethylaminopropyl)-carbodiimide]，是一种易潮湿、水溶性的化学药物，含有N=C=N官能团，其首先与肽链上游离的羧基反应形成活化酯中间体，再与游离的氨基反应，能够加速羧基与氨基之间酰胺键的形成，从而广泛应用于偶联反应和肽的合成[18]。1966年时Johnson等[19]在间接血凝实验中发现：ECDI可以将牛血清白蛋白(BSA)偶联到兔红细胞上。后来Wetzig等[20]在其研究中进一步证实：ECDI作为一种有效的偶联剂可稳定地将卵清蛋白(OVA)与小鼠脾细胞偶联。基于前人的研究，最近有研究者将ECDI应用于自身免疫病和器官移植模型中，并证实了ECDI修饰的同基因型脾细胞偶联抗原(Ag-SPs)或ECDI修饰的同种异体/异种脾细胞(ECDI-SPs)，可以成功地在宿主体内诱导出抗原特异性的免疫耐受，在预防和治疗Th1/17介导的自身免疫病[8]、Th2介导的过敏性疾病[21]，同种/异种细胞移植[22,23]以及同种器官移植中[24]，Ag-SPs/ECDI-SPs所诱导的免疫耐受均取得了显著疗效，并且这种诱导耐受方案目前已在多发性硬化症(MS)患者上进行临床Ⅰ/ⅡA期试验[25]。本文对ECDI在三种常见自身免疫病中的应用进行综述。

2.1多发性硬化症 多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)是一种以中枢神经系统炎性脱髓鞘为特点、由CD4+T细胞对髓鞘抗原自身应答所介导的自身免疫病[26]。

实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是人类MS应用最广泛，同时也是最经典的动物模型，因此常将小鼠的EAE模型用于人类MS的发病机理研究、治疗以及预防等。Smith等[27]在其实验中选用了4种致脑炎性髓鞘抗原肽(PLP139-151、PLP178-191、MBP84-104和MOG92-106)免疫SJL小鼠制备EAE动物模型。他应用ECDI将这4种抗原肽分别或者混合与小鼠的脾细胞偶联(Ag-SPs)，预先7 d将Ag-SPs静脉注射到小鼠体内发现，无论是在单个还是混合髓鞘肽免疫的EAE模型中，Ag-SPs都能有效预防临床EAE的发生。研究者认为Ag-SPs主要通过抑制外周特异性T细胞的记忆应答，降低促炎性细胞因子IL-2、IFN-γ的水平以及炎性细胞对脊髓的浸润等机制，极大降低了脑脊髓炎的发病率。接下来研究者在用PLP139-151或PLP178-191免疫的复发型EAE(R-EAE)模型中，用同样的处理方法，发现Ag-SPs仍然能够明显改善EAE的复发[28]。因此研究者认为，在EAE动物实验模型中，相对于传统治疗方法而言，Ag-SPs是一种更有效预防EAE发生、改善R-EAE复发的诱导耐受方法。其他研究者Turley等[29]也发现了同样的现象。在单用PLP139-151制备的EAE模型中，他们应用上述的处理方法观察到，Ag-SPs能够特异性抑制致病性T细胞的应答，预防EAE的发生。

2.2Ⅰ型糖尿病 Ⅰ型糖尿病(Type 1 diabetes，T1D)是由自身反应性CD4+和CD8+T细胞集聚并选择性地破坏胰腺β细胞所导致的一种慢性免疫性疾病[11]。在T1D动物模型制备中，NOD小鼠是最常用的一种小鼠品系[30]。

Prasad等[13]在NOD小鼠模型中，选用了多种T1D自身抗原：胰岛素(Ins B9-23、Ins B15-23)，IGRP(IGRP205-214)和GAD65(GAD65509-524、GAD65524-543)，应用ECDI将这些自身抗原偶联到小鼠SPs上，在幼龄小鼠未发病前(4～5周)静脉注射到小鼠体内，继而观察其发病情况。他们发现，Ins-SPs，尤其是Ins B9-23-SPs能够明显降低T1D的发生率，抑制IFN-γ的分泌，减少免疫细胞对胰腺胰岛细胞的浸润，从而对年幼的小鼠起到保护作用。

为了更好地研究Ag-SPs对人类T1D的治疗疗效，Niens等[31]人引用了一种人源化T1D小鼠-NOD.β2mnull.HHD。他们用ECDI将小鼠SPs与多肽混合物偶联(INS+IGRP)或与单个抗原(INS/IGRP)偶联，仍然在小鼠未发病(4～6周)时给予静脉处理。他们发现，与对照组相比，INS/IGRP-SPs能明显降低糖尿病的发病率，并进一步明确主要是IGRP-SPs在其中发挥了关键的保护作用。IGRP-SPs通过降低CD8+T细胞对IGRP特异性的应答，抑制IFN-α的分泌等机制抑制了糖尿病的发生发展[32]。这些结果均表明，无论在NOD小鼠，还是在人源化NOD.β2mnull.HHD 模型中，Ag-SPs都能特异性诱导出有效的、稳定的自身免疫耐受，从而保护幼鼠，避免T1D的发生[32]。

2.3过敏性疾病 过敏性哮喘是由嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞参与的慢性气道炎症性疾病，而食物过敏是由肥大细胞介导的消化系统内或全身性的免疫反应性疾病[33]，它们都属于由Th2型细胞介导的免疫性疾病。

Smarr等[21]在其实验体系中用了两个过敏症模型：卵清蛋白(OVA)诱导的过敏性气道炎症模型以及花生提取物(WPE)诱导的食物过敏模型。在过敏性气道炎症模型中，他们观察了OVA-SPs对局部炎症的控制情况，在第28天连续3 d给予雾化OVA吸入后，对支气管肺泡灌洗液分析发现，OVA-SPs处理的小鼠肺部嗜酸性粒细胞的数量明显下降，并且Th2细胞分泌IL-4、IL-5的水平也明显降低。不仅如此，全身性的过敏反应在OVA-SPs处理小鼠中也得到了有效抑制，血液中的嗜酸性粒细胞的数量以及血清OVA特异性抗体IgE的水平均明显降低。同样，在食物过敏模型中，预先给予WPE-SPs处理的小鼠，即使口服WPE后，仍能有效控制过敏症状，防止体温的骤降以及减少小鼠肥大细胞蛋白酶-1(mMCP-1)的释放，从而预防了全身性过敏反应的发生[19]。

综上所述，Ag-SPs诱导的特异性的自身免疫耐受不仅能有效预防、治疗由Th1/17介导的自身免疫病(如EAE、T1D)，对由Th2型细胞介导的过敏性疾病同样有效。

3 ECDI作用机制研究

ECDI作为一种传统的化学偶联剂，好像一架桥梁将抗原肽或蛋白偶联到细胞上，或者直接与细胞偶联，在多种自身免疫病以及器官移植模型中都成功地诱导出了针对抗原的特异性的免疫耐受。然而，在此种方法的基础上，Ag-SPs诱导免疫耐受的机制尚不完全明确，其可能的机制包括：

3.1诱导凋亡机制 近年来，有较多研究者在实验中发现，ECDI可快速诱导偶联的细胞发生凋亡[29,34]。凋亡的Ag-SPs通过静脉注射的方式进入到宿主体内后，迅速被脾脏边缘区的巨噬细胞吞噬、加工，经处理后的凋亡细胞免疫原性减弱，致耐受性增强，最后经宿主的抗原提呈细胞(APCs)以非炎性的方式重新递呈给自身抗原特异性CD4+T细胞，从而导致其克隆无能，失去或减弱对自身抗原的应答能力[29]。另一方面，在有抗原存在的情况下，ECDI首先与同基因型供体的脾细胞偶联，再与抗原游离的氨基与羧基交联，从而使抗原肽固定到供体细胞表面上，形成一个个“肽包裹着的细胞”，而这些细胞作为抗原的“载体”，经ECDI诱导发生凋亡后同样具有强大的致耐受性功能[25,35]。此外，Getts等[8]还发现，在ECDI处理3 h内几乎所有细胞失去其胞膜的完整性，并且Ag-SPs在进入宿主18 h内能被脾脏边缘区吞噬细胞完全吞噬清除，因此脾脏在Ag-SPs成功诱导耐受等方面也具有重要的作用。

3.2Treg的诱导调节机制 凋亡的Ag-SPs被宿主脾脏边缘区吞噬细胞吞噬的同时，也能诱导巨噬细胞分泌IL-10，IL-10可能通过自分泌的方式进一步上调PD-L1的表达。不仅如此，Ag-SPs还能明显诱导CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)的产生，Treg通过大量分泌IL-10和TGF-β等细胞因子发挥免疫调节作用。多个自身免疫病和器官移植模型的研究均表明，PD-1/PD-L1信号[36]和Treg[8,22]是维持其长期耐受的关键机制。Prasad等[13]在其研究中还发现，在Ag-SPs耐受诱导的起始阶段，Treg同样具有重要的调节作用，如果一旦缺乏Treg的表达，则会打破Ag-SPs的免疫耐受效应。

3.3共刺激信号分子通路机制 自身反应性CD4+T细胞逃避胸腺的阴性选择，在外周活化的APCs的递呈作用下，仍维持其对自身抗原的应答能力，而这也依赖于APCs表面共刺激信号分子的表达，即一旦缺乏共刺激信号分子，自身免疫性CD4+T细胞则活化无能。Podojil等[37]发现，Ag-SPs能明显降低偶联的APCs表面共刺激信号分子CD80/CD86的表达，从而在EAE等多个自身免疫病模型中安全、有效地诱导出了自身抗原特异性的免疫耐受。

当然，除了上述机制外，Ag-SPs还可能通过其他机制诱导抗原特异性的免疫耐受。比如，Ag-SPs可以直接调节TCR(宿主CD4+T细胞)与抗原肽MHC-Ⅱ类分子复合体的相互作用，从而阻断自身反应性T细胞的活化[38]；Eagar等[39]还报道，CTLA-4对于诱导和维持Ag-SPs介导的免疫耐受具有重要的调节作用。总之，Ag-SPs诱导耐受的机制并不是单一的，而是多种机制协同作用的最终结果。

4 小结与展望

相比传统的自身免疫病的治疗方案，ECDI修饰的同基因型脾细胞偶联抗原(Ag-SPs)诱导的免疫耐受主要具有以下优势：①较少的毒性作用和严重过敏反应；②能诱导抗原特异性的免疫耐受，个体化、特异性的治疗方案减少了传统免疫抑制剂广泛的药理作用所带来的副作用；③能够维持长期的免疫耐受，大量的动物实验以及临床试验已证明，这种诱导耐受的方法对绝大多数自身免疫病均有明显疗效[37]。综上所述，关于Ag-SPs用于自身免疫病的治疗和机制的研究意义重大，是极具前景的研究方向。

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