微小RNA对巨噬细胞发育和功能调节的研究进展①

吕 英 张林波 张文慧

(吉林农业大学生命科学学院病原微生物与免疫学实验室，长春 130118)

微小RNA(microRNAs,miRNAs) 是一类长度18～25 nt的单链非编码蛋白RNA，广泛存在于生物界中，从低等生物到人类，甚至古细菌和真细菌中都有其存在的痕迹。最初发现miRNAs是因为在生物体的发育过程中miRNAs具有调控细胞发育和分化的作用[1]。miRNAs通过与mRNA的3′非翻译区(UTRs)靶向结合，影响mRNA稳定性和翻译效率，降解mRNA或抑制mRNA翻译[2]。一个miRNA在某个细胞类型中有数百个靶mRNA，同时一个mRNA也是多个miRNAs的靶标，预测人体超过一半的转录组受miRNAs的调节，这个转录后的调节作用几乎贯穿整个生命过程[3]。有研究表明miRNAs在调节先天性和适应性免疫应答方面起重要作用，包括各种免疫细胞的成熟、发育、增殖、分化和活化，以及抗体产生、免疫反应、炎症介质释放和自身免疫性疾病等[4，5]。

巨噬细胞是先天性免疫系统中的一个成员，它可以通过模式识别受体或有限多样性抗原识别受体，对病原体及其感染细胞或衰老和畸变细胞表面某些共有特定表位分子的识别结合，起到免疫保护作用；同时参与适应性免疫应答的启动和效应过程。MiRNAs在巨噬细胞发育、活化、分化以及衰老等生物学过程中的调节作用受到了极大关注。本文将从miRNAs对巨噬细胞发育、极化、功能及凋亡的调节和与巨噬细胞相关疾病等方面进行综述，以期为miRNAs与巨噬细胞的相关研究提供理论参考。

1 microRNAs对巨噬细胞发育的调节

免疫细胞来源于骨髓中最原始的多能造血干细胞，多能造血干细胞可以分化为各种谱系造血细胞，成体造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)中的循环单核细胞是分化为巨噬细胞的主要前体[6]，所以对骨髓以及造血干细胞发育的影响因素同样会影响巨噬细胞的生成。2004年Chen等[7]研究发现，miRNAs在造血谱系中差异表达，其中miR-181在小鼠胸腺和骨髓中可以分别抑制不同的靶基因，导致T细胞减少和B细胞增多，证明miRNAs可以调节小鼠的造血功能。耐砷蛋白2(Arsenic resistance protein 2，Ars2/Asr2)是一种RNA结合蛋白，可以将miRNAs的转录产物转运到pri-miRNA微处理器复合体Drosha-DGCR中，2009年Gruber等[8]利用Ars2/Asr2基因敲除鼠研究miRNAs对骨髓发育的影响，发现敲除Ars2/Asr2后，小鼠的骨髓衰竭，这说明miRNAs在骨髓造血干细胞的生成和存活中起关键作用。2012年Lechman等[9]证明miR-126 通过靶向调节PI3K/AKT /GSK3β途径来调控HSCs的增殖，当miR-126在HSCs中高表达时会导致HSCs的循环过程受损伤，而抑制miR-126表达时HSCs则会增殖。2016年Shen等[10]发现在急性髓细胞性白血病(AML)患者外周血单核细胞以及骨髓单核细胞和CD34+造血干细胞中miR-22的表达水平显著低于健康对照组，当过表达miR-22时会通过调节其靶蛋白MECOM促进佛波醇乙酸酯(PAM)诱导的单核细胞/巨噬细胞发育和分化，这种促进分化的机制同样也存在于正常造血过程中，进一步研究发现，过表达miR-22时还可以缓解AML患者骨髓造血干细胞的分化障碍，并抑制AML患者骨髓原始细胞的生长。最近Bianchi等[11]研究miR-34a-5p在造血祖细胞恶性增殖和发展中的作用，发现淋巴增强子结合因子1(Lymphoid enhancer-binding factor 1，LEF1)和核受体亚家族4的A组成员2(Nuclear receptor subfamily 4,group A,member 2，NR4A2)的转录产物作为miR-34a-5p的靶标表达下调后，在造血祖细胞和原发性骨髓纤维化的CD34+细胞中miR-34a-5p的表达会上调；实验数据分析发现，在原发性骨髓纤维化的造血祖细胞中miR-34a-5p高表达可能对巨核细胞和单核细胞的生成具有重要意义。在循环单核细胞募集到组织分化为巨噬细胞过程中，一些miRNAs会响应于环境刺激导致其积累率发生改变，如脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)处理增加miR-146a和miR-155的积累，降低miR-27a积累，IL-4处理增加miR-193b和miR-222在发育过程中的积累，降低miR-125a-5p积累[12]。由此可见在单核细胞分化为巨噬细胞过程中，miRNAs具有重要的调节作用。

循环单核细胞是分化为巨噬细胞的主要前体，而循环单核细胞来源于造血干细胞，因此miRNAs对骨髓造血干细胞发育的调节作用都直接或间接影响巨噬细胞的发育过程。

2 microRNAs对巨噬细胞极化的调节

循环单核细胞可以分化成巨噬细胞进入不同的组织和器官，其具有可塑性和多样性的特点[13]，在受到局部微环境刺激后，会被激活并极化成不同亚型，发挥不同功能。根据激活途径的不同，一般将极化的巨噬细胞分为M1和M2两种亚型，M1亚型是由经典活化方式激活，而M2则是由选择性活化方式激活，并且M2又可以分成M2a、M2b和M2c三种亚型[14，15]。许多研究表明miRNAs在巨噬细胞极化过程中起关键调节作用。2014年Das等研究发现在炎症反应中miR-21可以介导巨噬细胞的M1表型向M2表型转变[16]。2015年Caescu等[17]发现miR-21可使巨噬细胞极化为M1型受到抑制，说明当巨噬细胞中有足够的miR-21对巨噬细胞极化成M2亚型至关重要。同年Zhuo等[18]的研究也得出了同样的结论，当巨噬细胞中miR-21的表达被抑制后会损害M2型巨噬细胞的基因表达，但却不影响M1型巨噬细胞基因的表达。由此可见miRNAs，尤其是miR-21在调节巨噬细胞极化方面具有重要意义。

同时也有些研究分析了已经极化的巨噬细胞中差异表达的miRNAs。2015年Karoatar等[19]检测分析分别用IL-4+IL-13和干扰素-γ(IFN-γ)刺激的骨髓衍生巨噬细胞miRNAs的表达谱，结果发现在用IL-4+IL-13诱导极化的M2型巨噬细胞中miR-511的表达量增加，由IFN-γ诱导极化的M1型巨噬细胞中miR-511的表达量减少；增加巨噬细胞中miR-511的表达量，会改变与巨噬细胞增殖、伤口愈合响应和炎症等功能相关的基因产物表达。2016年Jablonski等的研究发现miR-155在炎症反应中对M1型巨噬细胞具有调节作用，利用miR-155基因敲除小鼠，研究miR-155对M1(LPS+IFN-γ)和M2(IL-4)的影响，发现M1(LPS+IFN-γ)巨噬细胞中，炎症基因 iNOS，IL-1β和TNF-α及其相应的编码蛋白质或酶产物降低72%，但是miR-155的缺失却不影响M2(IL-4)巨噬细胞中精氨酸酶1(Arg1)的表达；在体外实验中用miR-155抑制剂转染野生型M1(LPS+IFN-γ)巨噬细胞，结果抑制了 iNOS基因的表达，对野生型M1(LPS+IFN-γ)巨噬细胞的基因转录谱分析发现约一半的基因(650个)依赖于miR-155。M1虽然保护机体免受感染，但是会引起炎症性疾病和组织损伤，若能选择性地激活M2则会减少炎症症状并促进组织修复[20]。

上述研究表明miRNAs在巨噬细胞极化和已极化的巨噬细胞功能方面都具有重要调节作用。一般将M1型细胞称为炎症型巨噬细胞、M2型称为抗炎症型巨噬细胞，分别在不同炎症阶段发挥不同功能，上述研究结果可为炎症的治疗提供新思路。

3 miRNAs对巨噬细胞功能的调节

巨噬细胞在免疫反应中发挥多种作用：感染初期，巨噬细胞受抗原刺激后产生炎性因子，进而激活中性粒细胞，启动炎症反应；向T细胞递呈所摄取的抗原，激活淋巴细胞功能，启动适应性免疫应答；吞噬细菌及衰老细胞，通过溶酶体消化所吞噬的异物，吞噬病原体后巨噬细胞具有两条杀菌途径，一是呼吸爆发，二是自噬。最近有很多研究报道，miRNAs对巨噬细胞的功能具有调节作用。

3.1炎症反应 巨噬细胞在免疫应答过程中的重要作用之一就是产生促炎细胞因子，近年来一些研究发现，miRNAs在炎症反应中起调节作用，影响巨噬细胞产生细胞因子。2013年Xie等[21]研究miR-181a的抗炎作用，荧光报告分析显示miR-181a的靶标为IL-1a mRNA的3′-UTR，在LPS诱导的Raw264.7和PMA/LPS诱导的THP-1细胞中过表达miR-181a，会导致IL-1a的表达水平显著降低，同时还抑制IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子表达。当抑制miR-181a表达时则出现相反现象，表明miR-181a具有抑制巨噬细胞炎症反应的作用。2015年Liu等[22]发现miR-223具有与miR-181a相同的调节作用，高表达miR-223时可以负向调控巨噬细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12p40的mRNA表达水平，同时还抑制NF-κB信号通路活化，说明miR-223通过抑制细胞因子产生和NF-κB活化来调节巨噬细胞的炎症反应功能。上述研究表明miR-223可能是通过作用于炎症相关信号通路而调节炎性因子的产生，而miR-181a则直接作用于炎性因子相关基因mRNA的3′-UTR。

3.2抗原呈递 巨噬细胞是一种抗原呈递细胞，可以激活适应性免疫应答，研究发现miR-125b、miR-24、miR-30b、miR-142-3p和miR-4270等在抗原呈递途径中对巨噬细胞功能具有调控作用。2011年Chaudhuri等[23]发现miR-125b在巨噬细胞中的表达量较其他免疫细胞显著升高，其作用位点为干扰素调节因子4(Interferon regulatory factor 4，IRF4，IRF4是巨噬细胞的促炎途径的负调节物)的3′-UTR隐藏保守位点，当巨噬细胞中miR-125b过表达时，会抑制IRF4的表达水平，从而促进巨噬细胞活化，并使细胞表面的MHCⅡ、CD40、CD86、CD80和IFN-γ受体表达增加，使巨噬细胞对IFN-γ的应答反应增强。同时发现过表达miR-125b会使巨噬细胞对刺激信号的敏感度增加，即增强了巨噬细胞的抗原呈递能力。然而，有些miRNAs却具有抑制作用，2016年Nagvi等[24]发现过表达miR-24、miR-30b和miR-142-3p时会减弱人原代巨噬细胞和树突状细胞中可溶性抗原卵白蛋白的摄取和加工，使其对CD4+T细胞的抗原呈递能力受到抑制，并减少T细胞增殖。最近Pagliari等[25]发现在幽门螺杆菌感染过程中miR-4270通过调控CD300E表达影响巨噬细胞抗原呈递功能。抗原呈递对激活适应性免疫应答具有重要的意义，上述研究均表明miRNAs在免疫应答过程中对巨噬细胞抗原呈递功能具有调控作用。

3.3吞噬功能 巨噬细胞具有吞噬细菌和衰老细胞的功能，摄入细菌和细胞后在胞质内形成吞噬体或吞饮小泡，与溶酶体融合后被酶消化分解。2013年Banerjee等[26]发现miR-125a-5p在M2巨噬细胞中表达量高于M1巨噬细胞，其靶标为Kruppel样因子13(Kruppel-like factors，KLF13，一种在T淋巴细胞活化和炎症中起重要作用的转录因子)，发现过表达miR-125a-5p会显著增强M1巨噬细胞吞噬凋亡细胞的能力。2014年Liu等[27]的研究发现miR-1通过抑制网格蛋白重链1( Clathrin heavy chain 1 ，CLTC1)基因的表达，抑制RAW264.7细胞的吞噬能力，使吞噬百分比显著降低。同年Moon等[28]发现细菌感染或LPS刺激，骨髓源性巨噬细胞中miR-15a/16的表达水平增加，当敲除miR-15a/16时，其通过靶向TLR4启动子区域的主要转录调控因子PU.1上调TLR4的表达，并进一步调控TLR4的下游信号分子，导致巨噬细胞吞噬作用增强以及线粒体活性氧产生增加，从而显著降低了细菌感染相关败血症小鼠的死亡率。

3.4呼吸爆发 巨噬细胞吞噬微生物后会以呼吸爆发的方式消灭病原菌，这是一种氧依赖性杀菌途径，在此过程中巨噬细胞会产生活性氧，可以通过检测活性氧含量评价其呼吸爆发功能。近年来有研究报道，miRNAs与巨噬细胞活性氧的产生有密切关系。如在酵母聚糖刺激下，与野生型骨髓来源的巨噬细胞相比，miR-451缺陷细胞会抑制活性氧的生成[29]；miR-181a和miR-15a/16具有与miR-451相反的调节作用，当二者被抑制时，巨噬细胞活性氧产生量增加[21，28]。2017年Huang等[30]发现miR-148a-3p是Notch途径(Notch途径在巨噬细胞的分化和极化激活中起关键作用)的新型下游分子，在粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)存在条件下会促进单核细胞向巨噬细胞的分化，并且过表达miR-148a-3p时，会通过调控PTEN/AKT途径增加巨噬细胞活性氧的生成，从而增强巨噬细胞的吞噬和杀菌能力，这提示miR-148a-3p是单核细胞或巨噬细胞相关疾病治疗的潜在靶点。

3.5自噬 巨噬细胞自噬功能的激活在机体抵抗微生物感染过程中起关键作用，当有难以清除的胞内寄生菌存在时，巨噬细胞会以自噬的方式减少胞内病原体的存活。2015年Kim等[31]发现miRNA-125a-3p影响结核分枝杆菌感染期间巨噬细胞自噬的激活，其靶基因为紫外线抵抗相关基因(UV radiation resistance-associated gene，UVRAG)，过表达miRNA-125a-3p会显著阻断结核分枝杆菌诱导的巨噬细胞自噬功能活化和吞噬体成熟，当抑制miRNA-125a-3p表达时结果恰好相反，说明miR-125a-3p可以通过靶向UVRAG抑制巨噬细胞自噬功能活化，从而调节宿主天然防御过程。2016年，Guo等[32]发现miR-20a和miR-144-3p具有同样的抑制作用，在BCG感染的巨噬细胞中miRNA-20a表达量增加，作用机制研究结果显示miRNA-20a通过靶向自噬相关蛋白(ATG7和ATG16L1)抑制巨噬细胞的自噬过程并促进巨噬细胞中BCG存活。2017年用同样的方法研究miR-144-3p的调节作用，发现miR-144-3p的靶基因为自噬相关基因4A(ATG4A)，同样抑制RAW264.7细胞中自噬体的形成以及促进BCG的存活[33]。巨噬细胞自噬具有积极意义，可以清除体内一些难以消灭的微生物，例如结核分枝杆菌，但是结核分枝杆菌能够抵抗这种自噬方式，因此上述研究可为结核病治疗及新药开发提供重要思路，可以通过调控miRNAs表达量从而达到调控巨噬细胞自噬的目的。

miRNAs作为一种调控分子，对巨噬细胞功能的调控作用以多种途径实现，但由于miRNAs的种类繁多，调控方式多样性等原因，其具体机制还需进一步深入研究。

4 miRNAs对巨噬细胞凋亡的调节

巨噬细胞凋亡对不同的疾病具有不同意义。2015年Li等[34]的研究发现miR-873可以抑制吗啡诱导的巨噬细胞凋亡。同年还有研究发现miR-21也具有相同的抗凋亡作用，作用机制是通过对其靶基因程序性细胞凋亡因子4(PDCD4)的作用从而抵抗高葡萄糖诱导的巨噬细胞凋亡[35]。巨噬细胞凋亡对结核患者具有积极意义，是机体抵抗结核病的先天性防御机制。在2015年Xi等研究发现与健康对照组相比，活动性结核患者外周血中巨噬细胞的凋亡率降低；然后在体外用H37Rv感染巨噬细胞，发现细胞中miR-223表达量明显增加，增加的miR-223会直接抑制叉形头转录因子O亚型3(FOXO3)，而过表达的FOXO3会显著减弱miR-223的抗凋亡作用，表明miR-223具有抗巨噬细胞凋亡的作用[36]。2016年Czimmerer等[37]用miR-342-3p模拟物转染RAW264.7巨噬细胞，与阴性对照相比miR-342-3p过表达后，巨噬细胞中有2 640个基因下调和2 341个基因上调，同时还发现miR-342-3p对巨噬细胞的抗凋亡基因有抑制作用，会通过靶向抑制人BCL-2样蛋白1(BCL2L1)基因而减少巨噬细胞的存活，促进细胞凋亡。综上研究，揭示了一些miRNAs对巨噬细胞凋亡过程的调节作用，但由于miRNAs和凋亡机制的多样性，miRNAs在巨噬细胞凋亡过程中的调节作用有待更深入的研究。

5 microRNAs与巨噬细胞相关疾病

巨噬细胞在很多疾病的发生过程中发挥重要作用。如在动脉粥样硬化中巨噬细胞具有降低脂蛋白和吞噬死亡细胞的功能，2014年Du等研究发现，miR-155表达量与促炎因子表达量呈正相关，过表达miR-155会增强巨噬细胞对LPS的炎症反应，在载脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠中发现miR155的缺乏会减少巨噬细胞的炎症反应，从而抑制转基因小鼠动脉粥样硬化的形成[38]。2015年Li等[39]检测野生型小鼠白细胞中ApoE的表达情况，发现只有巨噬细胞和单核细胞中ApoE表达量很丰富，若抑制巨噬细胞和单核细胞中ApoE的表达，会导致NF-κB(NF-κB信号传导会促进动脉粥样硬化的发生和进展[40])信号传导增强，并且用LPS刺激时会产生严重的炎症反应；进一步研究发现miR-146a是NF-κB信号传导的关键负调节因子，而ApoE使转录因子PU.1(PU.1是基因表达调控的关键元件)的表达上调，从而提高pri-miR-146转录产物的水平，证明ApoE可以通过增强单核细胞和巨噬细胞中miR-146a水平来抑制NF-κB介导的炎症和动脉粥样硬化[39]。2017年Hao等[41]用氧化的低密度脂蛋白诱导THP-1巨噬细胞作为体外动脉粥样硬化模型，发现miR-126对丝裂原相关蛋白激酶信号通路有调节作用，靶标是丝裂原活化蛋白激酶3K10(MAP3K10)，过表达miR-126会减少细胞因子释放，由此发现miR-126有作为动脉粥样硬化标志物的潜能，并且其过表达可能会阻止动脉粥样硬化的发展。同年Canfrán-Duque等[42]发现miR-21是巨噬细胞中最丰富的miRNAs，当巨噬细胞中缺少miR-21时其靶基因丝裂原活化蛋白激酶(MKK 3)的表达会增加，促进转运蛋白ABCG1翻译后降解(ABCG是调节巨噬细胞胆固醇流出的转运蛋白)，最终造成动脉粥样硬化加速，并且还会使斑块坏死和血管炎症发生，这些研究揭示了miR-21通过调节巨噬细胞，在动脉粥样硬化形成中发挥重要的作用。参与机体动脉粥样硬化发生的miRNAs有很多，他们主要通过调节巨噬细胞的功能而发挥作用，例如miR-19b通过靶向ATP结合转运蛋白A1 促进巨噬细胞中胆固醇的积累从而导致主动脉粥样硬化[43]；miR-33则通过促进M2 巨噬细胞的极化调节巨噬细胞的炎症反应，其拮抗作用可以保护动脉粥样硬化，减少斑块中的炎症反应[44]；miR-16则靶向调节程序性细胞凋亡因子4(PDCD4)和动脉粥样硬化中的NF-κB信号传导，从而抑制动脉粥样硬化中炎性巨噬细胞的活化，有望成为动脉粥样硬化治疗的潜在靶点[45]。

巨噬细胞也参与慢性便秘的发生，2015年Liu等研究慢性便秘的结肠组织中巨噬细胞和miR-128的表达水平及相关性，发现在慢性便秘患者的结肠标本中巨噬细胞数量升高，miR-128表达下调，通过线性回归分析发现巨噬细胞数与miR-128表达水平呈显著负相关；后续研究证实在人肠上皮细胞中蛋白激酶p38α是直接靶标，可能是肠蠕动受损造成慢性便秘的机制[46]。

巨噬细胞的M1表型在恶性肿瘤的免疫过程中具有重要的保护作用，而M2表型则表现出免疫抑制，是肿瘤恶化的特征之一。2014年Yang等发现在4T1小鼠乳腺癌细胞条件培养基中M2表型的RAW264.7巨噬细胞中miR-19a-3p 表达下调，进一步的研究发现这种下调是由于Fra-1基因(致癌基因)表达增加造成的，用miR-19a-3p模拟物转染RAW264.7巨噬细胞后会减少Fra-1基因及其下游基因的表达，由此表明miR-19a-3p可以调节小鼠巨噬细胞的极化，从而调控机体对恶性肿瘤的免疫保护[47]。

综上研究可以发现miRNAs通过对巨噬细胞的调节，在很多疾病的发生、发展以及免疫保护过程中都具有重要意义，这为一些疾病的诊断和治疗提供了新思路。

6 结语

巨噬细胞在机体的先天性免疫反应中发挥重要作用，当收到危险信号时，极化为不同亚型，进入相应部位，表达不同的效应分子，在肿瘤免疫、组织修复与重塑和病原体感染中发挥作用。上述大量研究表明miRNAs作为基因转录后调控分子，可以调控巨噬细胞发育、分化、功能、凋亡等，但miRNAs对巨噬细胞的某些调节机制以及miRNAs的相关靶分子还不甚清楚，由于一个miRNA在某个细胞类型中有数百个靶mRNA，同时一个mRNA也是多个miRNAs的靶标，因此目前已完成的miRNAs对巨噬细胞调控的一系列研究，并没有形成一个完善的调控网络，需进一步深入研究。本文就miRNAs与巨噬细胞发育、极化、功能、凋亡和与巨噬细胞相关疾病等方面研究进行综述，以期为miRNAs调节巨噬细胞的具体机制研究提供理论参考，为miRNAs作为潜在的巨噬细胞相关疾病诊断标志物或治疗靶标的研究提供新思路。

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