女贞子及其活性成分抗骨质疏松作用及途径研究进展

陈 楠，李晓莉，张 岩

(1. 上海中医药大学附属龙华医院脊柱病研究所，上海 200032；2. 教育部“筋骨理论与治法”重点实验室，上海 200032；3. 上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093)

骨质疏松症(osteoporosis, OP)是一种以骨量减少或(和)骨微结构破坏为特征，造成骨脆性增加，容易发生骨折的全身代谢性骨病。目前，世界卫生组织已将OP、糖尿病、阿尔茨海默病列为危害中老年人健康的三大杀手。随着人口老龄化现象的出现，OP的发病率也不断增加。全世界范围内，每3 s会发生1例骨质疏松性骨折。我国是全球OP患者最多的国家，40岁以上人群约有1.12亿患者，发病率高达19.74%[1]。目前，临床针对OP的治疗药物并不多，且大多不良反应比较严重，不能满足现阶段临床需要。因此，从中草药中寻找和开发新型抗OP药物已经成为热门研究课题，并具有重要临床意义。

女贞子为木犀科常绿乔木植物女贞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果实，最早见于《神农本草经》，谓其能“主补中，安五脏，养精神，除百病，久服肥健，轻身不老”，故列为上品。现代研究表明，女贞子药理作用主要包括降血糖、调血脂、免疫调节、神经保护、抗炎抑菌、抗细胞凋亡、保肝等[2]。近些年的基础研究不断深入，尤其在女贞子防治OP方面的研究取得突破进展[3]。本文依据国内外文献，对女贞子及其所含主要活性成分防治OP可能的作用途径与机制进行综述，为女贞子的进一步开发与临床应用奠定基础。

1 女贞子防治OP的作用途径

1.1调控钙代谢-维生素D系统维生素D2和维生素D3是与人类健康紧密相关的维生素D(vitamin D, VD)的两种营养分子，但这两种成分体内并无生物活性，需连续经过肝脏25-羟化酶、肾脏1α-羟化酶(1-OHase)的作用，转化为VD生物活性形式1,25-双羟维生素D[1,25-(OH)2D]，可增加肠道钙吸收，减少尿钙排泄，维持体内钙稳态，增强肌力，改善平衡。

Zhang等[4]发现，女贞子可以促进活性维生素D3生物合成、调控维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)和钙结合蛋白表达，促进肠钙吸收，抑制高尿钙排泄，提高老年♀大鼠、老年去卵巢大鼠[5]皮质骨的骨矿含量(bone mineral content, BMC)、骨密度(bone mineral density, BMD)[6]，提高糖尿病小鼠松质骨BMD[7]。据最近的两篇综述报道[8-9]，Zhang等是首次从中药及天然产物中发现并系统研究了女贞子调控钙代谢平衡、维生素D内分泌代谢的研究团队。随后，Dong等[10]研究发现，女贞子提取物给药后的假手术组大鼠、去卵巢(ovariectomized, OVX)组大鼠血清1,25(OH)2D3含量均明显提高，同时提高了假手术组大鼠肾脏1-OHase和VDR的蛋白、mRNA表达，以及OVX大鼠肾脏1-OHase的蛋白表达；体外实验中，女贞子提取物可以提高原代培养肾小管细胞1-OHase mRNA表达和活性，从而提高活性维生素D的生物合成，提高血液1,25(OH)2D3水平[7]，达到治疗OP的作用。另有研究发现，女贞子提取物可以上调处于生长期的♂大鼠[11]、♀大鼠[12]十二指肠黏膜钙主动转运蛋白，如钙结合蛋白表达，从而提高肠钙吸收，增加骨量，改善骨的性能。

1.2调控OPG-RANKL-RANK通路骨保护蛋白(osteoprotegerin, OPG)、核因子-κB受体活化因子(receptor activator of NF-κB, RANK)和核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)系统是目前发现的最重要的调控破骨细胞分化的通路，介导破骨细胞参与的骨吸收作用和骨重建过程。在调控成熟破骨细胞生成过程中，当破骨前体细胞膜的RANK与成骨细胞分泌的RANKL结合后，在肿瘤坏死因子受体相关因子的参与下，启动下游级联信号传导，最终诱导破骨细胞分化成熟，并且抑制破骨细胞凋亡。骨髓间充质细胞和成骨细胞在产生RANKL的同时，也产生了OPG干扰RANKL信号传导。OPG作为可溶性诱饵受体，竞争性地与RANKL结合，使其失去结合RANK的活性，负性调节RANKL-RANK的相互作用，从而抑制破骨细胞前体分化、存活与融合，诱导破骨细胞凋亡，使骨吸收与骨形成达到一个相对平衡的状态。因此，OPG-RANKL-RANK信号系统相互制约，综合调控着骨密度和骨强度。

Lyu等[12]给大鼠分别喂饲具有女贞子提取物不同含量(0.40%、0.65%、0.90%)的AIN-93G饲料，16周后发现，女贞子提取物明显降低血清骨吸收标志物CTX-I的含量，同时降低RANKL/OPG比值。有研究人员通过对RAW264.7小鼠巨噬细胞的体外培养发现，女贞子提取物可以通过抑制RANKL通路来减少破骨细胞，降低RANKL/OPG比值，达到抗骨质疏松的作用[13]。Li等[14]使用女贞子水提取物处理MC3T3-E1成骨细胞，发现女贞子对成骨细胞存活率不仅存在着浓度依赖性，还存在时间依赖性，此外，通过ERK、p38、Akt等信号通路，调控MC3T3-E1细胞OPG、RANKL分子的表达，从而影响破骨细胞的成熟。

1.3调控CaSR-PTH轴甲状旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)是维持血钙平衡的重要激素之一，可以促进钙的重吸收，减少钙从尿液中排泄，间接提高肠道对钙的吸收，提高骨密度、骨强度和改善骨的微结构。PTH的合成与分泌受位于甲状旁腺的钙敏受体(calcium-sensing receptor, CaSR)所调控，而CaSR的活性取决于血循环中Ca2+的浓度变化。Dong等[15]将4月龄成熟♀SD大鼠随机分组，分别喂饲钙含量为0.1%、0.6%、1.2%的低钙、中钙、高钙饲料，发现女贞子水提物有效升高中钙组、高钙组大鼠血清PTH水平，减少尿钙、粪钙含量，维持体内钙平衡。Zhang等[7]发现，女贞子水提物可明显纠正糖尿病小鼠钙代谢失衡，并将血清PTH水平提高46%，同时，通过调控肾脏CaSR的mRNA、蛋白表达，提高肾小管对钙的重吸收能力。

1.4调控骨髓间充质干细胞定向分化女贞子可以促进成骨细胞的增殖，增加骨形成，改善骨代谢，发挥抗骨质疏松的作用。通过女贞子水提取物对老年大鼠骨保护作用的机制研究[16]，发现女贞子能够刺激骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向成骨细胞分化[17]，抑制其向脂肪细胞和破骨细胞分化。通过对女贞子的体内、体外实验研究发现，女贞子可能是通过增加MSCs细胞外基质、增加基质蛋白质合成、促进生长因子相关信号通路等途径，促进MSCs向成骨细胞分化。随后研究采用检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性和矿化作用来评价MSCs的成骨分化能力，结果发现，女贞子可以明显刺激ALP活性，缩短MSCs增殖分化时间，同时MSCs向成骨细胞分化过程中的部分调控因子表达也出现上调，最终发挥抗骨质疏松作用。

1.5抗氧化作用氧化应激是人体内的正常现象，参与体内氧化-还原平衡的各种酶系统维持了生理状态低水平活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平。ROS作为细胞内的氧化-还原信号分子，参与调控骨代谢，包括RANKL依赖的破骨细胞的分化。Wang等[18]将♀大鼠双侧卵巢切除后，按照大鼠重量每千克给予3.5 g女贞子水提物，灌胃处理12周，发现血清总抗氧化能力(total antioxidant capacity, TAC)和一氧化氮水平增加，血清、胫骨、子宫丙二醛和8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG)水平下降，而且胫骨和子宫腔内的NOX4、NF-κB p65、p-IκBα的表达下调，这些实验数据都表明女贞子具有一定的体内抗氧化作用。在骨组织，女贞子可能通过抑制NOX4/ROS/NF-κB信号通路，达到抗骨质疏松的作用，从而提供了另一条女贞子防治OP的可能作用途径。

2 女贞子在复方中的应用

中成药二至丸，由女贞子和墨旱莲两味药组成，其中女贞子为君药，墨旱莲为臣药，各占50%，滋肾养肝，治疗因肝肾阴虚导致的头晕耳鸣、腰膝酸痛、失眠多梦等。Cheng等[19]对60只3月龄OVX大鼠进行随机分组处理，结果发现，二至丸可以明显抑制大鼠卵巢切除后引起的骨丢失和骨小梁微结构改变，提高OVX大鼠血钙、血磷水平。此外，二至丸能在一定程度上促进围绝经期妇女成骨细胞增殖分化。有学者基于UPLC/Q-TOF-MS技术，采用PCA和OPLS-DA方法分析了二至丸中女贞子与墨旱莲配伍前后化学成分的变化，研究表明二者配伍前后成分含量差异明显，主要的指标性成份含量明显升高，而且女贞子中的三萜类、环烯醚萜类、苯醇类成分，以及墨旱莲中的三萜皂苷类、黄酮类、有机酸类成分在两药配伍后溶出量增加，这对机体的吸收发挥重要作用，从化学成分含量变化的角度，初步揭示了女贞子与墨旱莲药对配伍的科学内涵。

根据中医药理论，骨健康与肾功能密切相关，而肾虚被认为是骨骼和骨关节相关疾病的根源。由于女贞子通常被用作补足肾阴虚，所以会和补足肾阳虚的淫羊藿组成复方，该复方可以通过减缓骨代谢来减轻骨质疏松大鼠病理症状，并且提高骨矿含量和力学性能。Yang等[20]将女贞子和淫羊藿两种药材以3 ∶4的比例混合，对糖皮质激素性骨质疏松大鼠给药8周，与对照组相比，复方药物能明显增加血清骨源性碱性磷酸酶(B-ALP)、血清骨γ羧基谷氨酸蛋白、血清骨形态发生蛋白-2等骨代谢标志物，降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶和I型胶原羧基末端肽交联含量，抑制骨吸收和增加骨密度，改善骨的力学特性。

含淫羊藿(E)、女贞子(L)和补骨脂(P)三味药的传统复方制剂ELP已被证明能明显抑制老年去势♀骨质疏松大鼠脊柱BMD丢失。对3月龄SD大鼠进行尾悬吊法建立废用性骨质疏松模型，将女贞子、淫羊藿以及补骨脂按照生药材重量比4 ∶5 ∶1的比例混合、浸泡、蒸馏，制成复方水提物，发现复方ELP可以明显抑制大鼠后肢的BMD流失[21]。进一步实验研究发现，ELP提取物明显上调MSCs的ALP基因表达，可以促进成骨细胞活性。另有研究将复方ELP的3种单味药进行排列组合，将复方ELP与其他组合比较，以考证复方ELP抗骨质疏松作用。从各组合不同药物代谢动力学参数可以明显发现，ELP组合更加有效，在抗骨质疏松方面3种草药出现协同增效作用。

3 女贞子活性成分抗骨质疏松作用研究

女贞子化学成分包括三萜类、黄酮类、环烯醚萜类、苯乙醇苷类等化合物，根据中药系统药理学数据库和分析平台收录，女贞子中所含化合物超过200种之多，其中女贞子主要活性成分是齐墩果酸、熊果酸、红景天苷、苷元酪醇等。

3.1齐墩果酸(oleanolicacid,OA) OA属于五环三萜类化合物，常以游离体和配糖体存在于女贞子等多种植物中。OA具有多种生物学作用，如抗病毒、消炎、抗氧化等，且细胞毒性较低。随着对OA的不断深入研究，目前已经证明，OA在动物实验中提高去卵巢和更年期大鼠体内雌二醇水平；提高绝经期妇女的外周血清雌激素受体表达水平。3月龄小鼠去卵巢造模1周后，经OA治疗3个月，发现OA能够明显抑制OVX小鼠破骨细胞活性，增强骨密度。Shu等[22]进一步揭示了OA对MSCs向成骨细胞分化的影响，发现OA在诱导MSCs分化过程中，ALP染色明显增强，且存在剂量依赖性，表明OA可诱导体外骨髓基质干细胞成骨。为了寻找可能参与这一过程的调控分子，通过RT-PCR定量鉴定了几种成骨标记物基因。相比于对照组，早期成骨细胞标记物I型胶原(COL1A1)、ALP、转录因子Runx2的表达增加，而晚期成骨标记物OC和OPN保持不变，这表明OA主要在MSCs成骨分化的起始阶段起作用。

3.2红景天苷(salidroside,SAL) SAL属于酚苷类化合物，可以从天然植物中提取，也可以人工合成，主要药理作用包括抗肿瘤、保护心肌缺血损伤、保肝护肾等。SAL体内、外具有较好的抗氧化应激作用。低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)在骨生成和骨的发育中起着至关重要的作用。有研究报道[23]，小鼠源成骨细胞MC3T3-E1经H2O2刺激后，相较于模型组，SAL能明显提高细胞存活率，提高ALP活性、钙沉积，降低细胞内ROS的产生，上调ALP、COL1A1、OC的转录水平，并下调诱导破骨细胞分化的细胞因子如RANKL、IL-6表达，通过降低骨吸收因子和减少氧化损伤来达到防治骨质疏松作用。Li等[24]以人成骨样细胞MG-63和新生大鼠颅骨成骨细胞(rat osteoblastic cell，ROB)为研究模型，体内以OVX大鼠为模型，研究细胞中常氧和低氧状态下，SAL对HIF-1信号通路的调控作用。结果表明，SAL预处理能明显减轻细胞缺氧所导致的活力下降、凋亡，下调HIF-1的表达，但是HIF-1的转录活性增加，从而上调血管内皮生长因子；体内研究发现，SAL改善了OVX大鼠骨小梁结构，增加股骨远端骨密度。

4 小结

一系列基础研究与临床研究结果显示，女贞子及其复方都具有较好的抗骨质疏松作用[25]。已有的药理研究揭示女贞子可通过多种作用途径发挥抗骨质疏松作用，这为女贞子的药物开发与综合利用，尤其是抗骨质疏松中药研发提供了坚实的实验基础。女贞子所含的某些活性成分也显示具有抗骨质疏松作用，对其药理作用机制还有待深入研究，尤其是哪些活性成分具有调控维生素D代谢、CaSR-PTH轴等的生物学作用，需要后续进一步探索。