表观遗传学在肺动脉高压发病机制和治疗中的研究进展

张春芳，徐双兰，赵方允，邢西迁，杨 姣

(昆明医科大学附属延安医院 1. 呼吸内一科、2. 药学部，云南 昆明 650051；3. 昆明医科大学第一附属医院呼吸内一科，云南 昆明 650032)

肺动脉高压(pulmonary hypertension, PH)是指肺动脉压力超过一定界值的一种血流动力学异常状态，导致右心负荷增大和右心功能不全，从而引起一系列临床表现。PH的病理生理特点为肺动脉压力的升高及肺血管阻力的增加，通常导致右心衰竭和死亡。表观遗传学是研究在DNA序列没有改变的情况下，基因功能可逆的、可遗传改变的一门生物学学科[1]。大量研究表明，表观遗传学修饰异常在人类复杂性疾病如恶性肿瘤、神经精神疾病、心血管疾病等的发病机制中起重要的作用[2-4]。近年来，表观遗传学在PH方面的研究逐渐增多，其在该病发生、发展中的重要作用越来越被人们所认识。表观遗传学机制是基因和环境相互作用产生的，研究发现，超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD2)和颗粒容素基因位点的DNA甲基化状态、组蛋白H1水平、组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)、microRNA的失调，这些因素相互作用形成表观遗传修饰调控网络，共同参与PH的表观遗传学机制[5-6]。一些环境因素可能通过目前尚未发现的表观遗传学机制，导致PH的发生[1]。然而，有许多至今未阐明的PH的表观遗传成分。本文主要对DNA甲基化和组蛋白修饰在PH发生、发展中的作用，DNA甲基化转移酶抑制剂、HDACs抑制剂及其他潜在治疗靶点对PH的治疗作用及机制进行综述。

1 表观遗传学的基础理论

DNA甲基化、组蛋白修饰和microRNA是目前研究最广泛和最深入的表观遗传分子机制。表观遗传在环境的影响下参与基因表达调控。

1.1DNA甲基化DNA甲基化是由DNA甲基转移酶催化发生，并维持与调控。在哺乳动物细胞中，胞嘧啶特异性甲基转移酶使CpG二核苷酸序列发生甲基化，从而调节基因表达和细胞分化[7]。DNA甲基转移酶的作用主要是抑制DNA转录。CpG岛发生甲基化会引起抑癌基因的沉默，原癌基因的低甲基化会引起该基因的过表达，这两方面会导致肿瘤的形成[2]。总之，DNA甲基转移酶对于DNA甲基化模式的调控至关重要，它们在机体发育以及疾病的发生、发展中都发挥重要作用。

1.2组蛋白修饰在常规的核小体中，共有4种组蛋白，H3、H4、H2A、H2B。每种组蛋白的2个拷贝结合在一起，形成了一个组蛋白八聚体；约146 bp的DNA片段按照左手螺旋的方式在这个八聚体外缠绕约1.8圈，就构成了1个核小体的核心颗粒。核小体通过控制DNA和组蛋白的结合性和转录活性，调节基因表达[7]。组蛋白的翻译后修饰是表观遗传调控的核心手段。目前，已经发现了至少8种不同的修饰类型，其中最为常见的4种修饰，即乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化，且都是可逆的[7]。乙酰化是最常见的表观遗传修饰。组蛋白乙酰化修饰发生在赖氨酸残基，修饰的位点主要分布在H3和H4的N端尾部，组蛋白乙酰化水平升高与转录活性增加相关[1]。组蛋白乙酰化和去乙酰化是一个动态过程。翻译后的广泛组蛋白修饰的组合构成“组蛋白代码”，是调控染色质结构和功能的重要手段[1]。

1.3非编码RNA与基因表达调控非编码RNA主要包括4类。第1类是管家基因的转运RNA、核糖体RNA、核小RNA；第2类是小干扰RNA、与PIWI蛋白相互作用的RNA,它们是非编码RNA中重要的一部分；第3类是microRNA,它起到一种微调的作用；第4类是长链非编码RNA,它在基因调控中不仅能激活基因，还抑制基因。

2 表观遗传学成分在PH发生、发展中的机制

2.1DNA甲基化与PH

2.1.1SOD2 SOD2位于线粒体中，是内生的过氧化氢产生的主要来源。在生理层面上，过氧化氢是扩张血管、抗细胞增殖、氧化还原反应的信号分子[8]。SOD2是肿瘤抑制基因的候补者，在很多恶性肿瘤中是沉默状态，如多发性骨髓瘤和胰腺癌中，SOD2基因启动子区CpG岛的甲基化导致该基因沉默[1]。肿瘤细胞中SOD2基因的去甲基化会恢复SOD2的活性，增加过氧化氢的生成，抑制肿瘤细胞的增殖，SOD2的甲基化也同样出现在PH患者中[8]。

过量的活性氧和还原型辅酶Ⅱ氧化酶类的表达增加，在促成PH方面有重要作用，还原型辅酶Ⅱ氧化酶类是活性氧的主要来源[9]。正常情况下活性氧不断地产生，同时也不断地被SOD2等清除，保持一种平衡状态。SOD2基因的甲基化，一方面降低了过氧化氢的产生，另一方面减少了对活性氧的清除。基因组测序表明，SOD2基因CpG岛的甲基化选择性地发生在肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)，而不在主动脉平滑肌细胞。据研究，在PH患者或动物模型的丛状病变中分离出的PASMCs中，SOD2出现甲基化，使SOD2表达降低，减少过氧化氢的生成,激活低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α) 的活性，导致凋亡蛋白酶被抑制，增加细胞增殖/凋亡率，促成患有PH的患者和Fawn-hooled鼠的血管阻塞，肺动脉压力升高[1, 8, 10]。

2.1.2颗粒溶素 最近从人类的外周血单核细胞和移植肺中提取的基因组DNA分析结果显示，患有肺静脉闭塞病的颗粒溶素基因的甲基化程度要比PH患者高，具体的分子机制还有待进一步研究。颗粒溶素基因可能为PH治疗提供创新性的治疗靶点[11-12]。

2.1.3胰岛素样生长因子-1 胰岛素样生长因子-1信号的表观遗传调控包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化修饰，在新生儿PH发病机制中起重要作用。胰岛素样生长因子-1信号分子的异常，导致肺动脉血管内皮细胞、平滑肌细胞功能紊乱，进而导致血栓形成、细胞异常增殖。进一步深入研究胰岛素样生长因子-1信号通路的表观遗传学改变，可能为新生儿PH的治疗带来新思路[13]。

2.1.4ATP结合盒转运子A1 最近研究表明，PH患者的肺内皮细胞中，涉及脂质转运途径基因ATP结合盒转运子A1的甲基化，使ATP结合盒转运子A1的mRNA和蛋白表达下调，导致肺内皮细胞功能障碍，这可能与PH的病理生理有关[14]。

2.2组蛋白修饰与PH

2.2.1内皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS) 有研究表明，eNOS的超乙酰化与新生儿持续性PH的形成有关[15]。研究者通过给孕期大鼠吲哚美辛和宫内缺氧来诱导新生鼠持续性PH模型，发现在这种大鼠肺动脉内皮细胞中eNOS的表达量明显增加，是eNOS的启动子乙酰化所致。在此模型中，eNOS的表达上调与eNOS启动子区域的H3和H4组蛋白乙酰化的升高有关，而且eNOS甲基化轻度降低[1]。导致eNOS超乙酰化的原因及在治疗PH时怎样去避免eNOS超乙酰化，有待进一步研究。

2.2.2肌细胞增强因子2(myocyte enhancer factor 2，MEF2) MEF2是转录因子的一个家族，它在细胞分化与胚胎发育方面有重要作用。MEF2家族主要有4个成员：MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D。其中，MEF2A和MEF2C在内皮细胞中高表达。内皮细胞特异性MEF2C缺乏小鼠视网膜血管的损伤减少，内皮细胞的凋亡降低，这表明MEF2在血管内是一个重要的内皮稳态转录因子[16]。最近研究表明，MEF2不仅在内皮中具有重要作用，而且在维持肺血管的动态平衡中也有效。MEF2的活性受损，导致肺动脉血管动态平衡的靶基因下调，包括miRNA-424和miRNA-503等， 进而导致PH的病理学变化[17]。

2.2.3内皮素-1 内皮素-1是一种强烈的血管收缩活性物质，可引起血管收缩和细胞增生。研究发现，新发生的低氧性PH的患者血清中内皮素-1、HIF-1α水平与肺动脉收缩压呈正相关[18]。缺氧导致的胎儿宫内发育迟缓大鼠，在以后的生活中可引起不同程度的PH和肺血管重塑。研究证实，胎儿宫内发育迟缓很可能与组蛋白乙酰化水平和HIF-1α在内皮素-1基因核心的启动子区域结合水平升高有关。这些表观遗传变化可能导致胎儿宫内发育迟缓大鼠在以后的生活中对缺氧高度敏感[19]。持续低氧导致肺动脉内皮细胞的损伤，内皮细胞所释放的一氧化氮、内皮素、前列环素等活性物质发生异常，从而引起肺血管异常收缩，导致更严重的PH或肺血管重构[20]。结果表明，表观遗传学与继胎儿宫内发育迟缓之后的缺氧性PH的发展有关，为进一步提高胎儿宫内发育迟缓相关的PH的预防和治疗提供了一种新方向。

2.2.4线粒体去乙酰化酶3 最近发现，在特发性PH患者的PASMCs中，局限性的线粒体去乙酰化酶3的表达降低。敲除线粒体去乙酰化酶3的小鼠，线粒体去乙酰化酶3的表达量降低能够抑制线粒体的功能，抑制细胞凋亡，激活数个与PH相关的转录因子，如HIF-1α、信号转换器、活化T细胞的细胞核因子[11]。

2.2.5超氧化物歧化酶3(extracellular superoxide dismutase，EC-SOD或SOD3) SOD3是一种胞外的超氧化物歧化酶，能够快速地把超氧化物分解成过氧化氢。SOD3是脉管系统中最丰富的一种超氧化物歧化酶，占所有SOD活性中的60%～70%。在PH或者其他心血管疾病的动物模型中，缺失SOD3会增加疾病的严重程度。研究表明，血管抗氧化酶SOD3，而不是SOD2的表达量在特发性PH中选择性减少，其活性也降低。在众多肿瘤的研究中，并没有发现DNA的超甲基化可以降低SOD3的表达量。现已证实，Ⅰ类HDAC3可以降低SOD3的表达，增强特发性PH PASMCs的增殖。SOD3对不同类型的PH患者的细胞特异性调控机制，确定选择性HDACs抑制剂是否可以提高SOD3的活性，还需进一步研究[21]。

3 表观遗传学与PH治疗

3.1DNA甲基化转移酶抑制剂用DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮-2′脱氧胞苷(5-aza-2′deoxycytidine，5-Aza-CdR)逆转SOD2基因的甲基化状态，不仅可以恢复SOD2的表达，提高细胞凋亡率，还可以降低患有PH的Fawn-hooled鼠PASMCs异常增殖；同样，过表达PASMCs的SOD2基因或者通过提供SOD类似物(MnTBAP)可以逆转PH Fawn-hooled大鼠PASMCs的过度增殖[10]。SOD2补充给药和5-Aza-CdR在细胞实验中都有效，表明这两种方法在治疗SOD2甲基化方面有较大作用，但是，目前SOD2表达量减少导致的PH发生、发展最主要的治疗方法还是SOD2类似物MnTBAP。经证实，MnTBAP能够逆转活体PH的形成，并降低肺毛细血管前阻力血管的肌化[8,10]。

3.2HDACs抑制剂HDACs基因的表达通过乙酰化修饰控制PH，HDACs去除组蛋白上赖氨酸尾巴上的乙酰基团。通常去乙酰化会导致染色质浓缩，降低基因转录。HDACs抑制剂如丙戊酸，是HDAC I类抑制剂，用于治疗癫痫和抗肿瘤；肟异羟肟酸是一个广谱HDACs抑制剂，批准用于 T细胞淋巴瘤的治疗。以上两种药物在治疗PH模型方面有效[11]。I类HDACs抑制剂通过拮抗血小板源性生长因子对PASMCs的作用，抑制PASMCs的增殖和迁移，表明组蛋白去乙酰化酶与PASMCs的过度增生有关，抑制去乙酰化会产生细胞凋亡的效应[22]。HDACs抑制剂可以通过抗血管生成、促进细胞凋亡，实现逆转右心室的功能，HDACs抑制剂也降低了心肌的纤维化[22-23]。还有研究表明，另一种HDACs抑制剂曲古抑菌素A通过增加特发性PH PASMCs中SOD3的表达，部分逆转特发性PH[21]。然而，并不是所有的研究结果都得出HDACs抑制剂有利于右心室肥厚的逆转。有研究报道，曲古抑菌素A处理的大鼠出现心输出量减少和右心衰竭的迹象，这种结果和之前研究的HDACs对右心室肥厚和左心室肥厚有益相反。这表明可能有多种HDACs抑制剂，需要进一步研究一个特定的HDACs家族中是否有一特定的抑制剂亚型对右心室肥厚有益或有害[1, 23-24]。

4 结语

近年来，表观遗传学在PH方面研究发展迅猛，至今已发现很多可能与PH的发生、发展机制相关的表观遗传学成分，并对DNA甲基化和组蛋白乙酰化进行了药物干预。文献报道，DNA甲基转移酶抑制剂和HDACs抑制剂在治疗多种肿瘤方面可能有效[25]，但对于治疗PH的动物实验效果并不确切，有些还存在严重副作用。随着分子生物学技术的突飞猛进，希望今后的研究中，对于已经确定的甲基化药物干预和组蛋白去乙酰化药物干预进行更精确的靶向治疗；通过基因组学、蛋白质组学和代谢组学的高通量技术，进一步研究导致PH发生、发展的机制，发现新的表观修饰作用的靶点，并对其进行靶向药物或技术干预。虽然此过程可能不是一帆风顺，但可以肯定的是，表观遗传修饰药物或技术干预具有广阔的应用前景。