骨髓基质干细胞在治疗脊髓损伤中的应用

杨国宏 潘艳明 赵富生

【摘要】 骨髓基质干细胞（BMSCs）具有取材简单、增殖速度快、抗原性小和培养过程中始终保持多向分化的潜能等特点，已经成为干细胞研究领域的热点，是最好的组织工程种子细胞之一。近年研究发现这类细胞具有高度分化的潜能，能分化为神经细胞，为脊髓损伤（SCI）的修复提供了一条新的途径，具有广阔的临床应用前景。

【关键词】 骨髓基质干细胞； 脊髓损伤； 多向分化潜能

【Abstract】 Bone marrow stromal cells（BMSCs） has been considered the hot spot in the study of stem cells owing to their characteristic that is easy to be acquired and be cultured in vitro，negligible antigenicity and keeping multi-differention potentiality and so on.Now，it is one of the best seed cells for tissue engineering stem.In recent years，it is found that marrow stromal cell has well-differentiated potential and it can differentiate into nerve cell and then provide a new strategy to the reparation of spinal cord injury，and it will be using comprehensively in clinical application.

【Key words】 Bone marrow stem cells； Spinal cord injury； Multi-differention potentiality

First-authors address：Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.31.039

脊髓損伤（SCI）是一种严重的中枢神经系统疾病，全球每年因各种原因所造成的SCI患者达五十多万人，目前治疗SCI主要是采用药物和手术以及后期康复治疗等手段[1-3]，这些方法在一定程度上缓解了SCI的病情，但治疗效果并不理想，患者往往会出现一定程度的功能障碍。因此，SCI的治疗是急需解决的医学问题，近年来随着干细胞研究的深入，为SCI的治疗带来了希望。由于骨髓基质干细胞（BMSCs）较其他移植细胞具有取材容易、培养方便、可以传代并且不改变细胞生物学特性和抗原性、以及没有伦理问题等优点[4-5]，故受到学者的极大关注。本文就BMSCs治疗SCI的主要研究进展做一综述。

1 BMSC的生物学特性及其分离与培养

1.1 BMSC的生物学特性 体外培养的BMSCs在形态学上主要表现为梭形或纺锤形，核质比大，细胞器少，相邻细胞之间存在缝隙连接。Forostyak等[6]研究表明，BMSCs在培养分化时表现出贴壁性、可移植、可塑性、可自我更新、克隆速度快等生物学特性。Tamir等[7]研究发现，大多数BMSCs处于G0/G1期，表明该细胞具有强大的增殖能力。体内条件下，BMSCs可以向多种组织迁移并分化为相应的局部细胞，Ferraru将标记的BMSCs经血管注入实验动物体内，结果发现在受损的肌组织内出现了有被植入BMSCs标记基因的肌细胞，表明植入的BMSCs迁移到受损的肌组织并分化为肌细胞[8]；Brazerlton等[9]观察到植入的BMSCs在小鼠中枢神经系统内分转化为神经细胞，在体外，使用不同的诱导剂，可使BMSCs分化为相应的组织细胞；文献[10]采用体外诱导的方式使BMSCs分化为神经细胞。BMSCs通过分泌白细胞介素12（IL-12）来诱导产生粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），改善损伤处的细胞生存环境[11]。BMSCs具有低免疫原性，使其逃避NK细胞和细胞毒性T细胞的杀伤作用[12]。研究表明，BMSCs对机体的免疫功能具有调节作用，可抑制B淋巴细胞、T淋巴细胞和抗原呈递细胞等多种免疫细胞的活性[13-14]。

1.2 BMSCs的分离方法 常用的分离方法如下，（1）密度梯度离心法：根据BMSCs与其他细胞的密度不同，将骨髓过滤去除骨屑，加分离液后离心，吸取位于界面的BMSCs后进行培养[15]。（2）贴壁筛选法：根据BMSC具有较强的贴壁能力，把全骨髓置于培养基中，经过一段时间的培养，非BMSCs会因没有贴壁的功能而随着不断地换液被清除掉，最后剩下贴壁的BMSCs[16]，该方法具有简便实用、对细胞活性影响小等优点。将密度梯度离心法与贴壁筛选法进行比较，发现贴壁筛选法获得的BMSCs贴壁速度快，细胞数量明显多于密度梯度离心法[17]。（3）流式细胞仪法：根据BMSCs体积小、颗粒少的特点对其加以分离，此法分离BMSCs纯度高，但细胞数目少且活性降低[18]。（4）免疫磁性法：利用包有抗体的磁珠与BMSCs表面抗原特异结合的原理，采用一定强度的磁场或流式细胞仪来分离细胞[19]。贴壁筛选法和密度梯度离心法是目前分离BMSCs最常采用的方法。

2 BMSCs的移植

2.1 移植时间的选择 BMSCs治疗SCI的最佳移植时间，目前尚无定论，有学者观察不同时间窗BMSCs移植在SCI大鼠内存活和迁移的影响，发现SCI后第3天是最佳的移植时间[20]。文献[21]报道显示SCI后进行BMSCs移植的最佳时间是在损伤后7～14 d内。Ritfeld等[22]的研究表明BMSCs在SCI后7 d内植入对神经的保护作用最理想。鉴于SCI后的几天内脊髓损伤处可出现广泛的坏死和严重的炎症反应，而在损伤12～14 d后，损伤处可出现囊肿和胶质瘢痕，因此笔者认同Lu等[23]的BMSCs移植的最佳时间应为SCI后第9天前后的观点。

2.2 移植方式 BMSCs移植方式主要包括直接注射、经脑脊液注射、静脉输入、诱导分化后移植等方法。直接注射是指在损伤部位直接注射BMSCs悬浮液；后几种方法是将细胞悬浮液分别经腰穿或静脉注入脑脊液或静脉血中，通过细胞的迁移作用到达脊髓损伤部位。直接注射保证了干细胞能移植到损伤部位，但需要承受麻醉、脑脊液外漏以及受损神经组织发生炎症的风险，而且还需要多次注射，这使得其临床应用受到很大限制。静脉注射是一个简单的办法，但细胞还未到达脊髓损伤部位就可能已经定植在其他器官，更重要的是脊髓损伤大多伴有其他器官损伤，细胞移植后可能迁移到所有受损区域，这使得干细胞并没有全部到达脊髓损伤区域。经脑脊液注射的方法不需麻醉，操作简便，只需在椎间隙进针，不会伤到脊髓。研究者经腰椎间隙将BMSCs注入大鼠蛛网膜下腔，观察发现BMSCs会聚集在脊髓损伤区的表面和血管周围，说明BMSCs能够通过脑脊液循环到达脊髓损伤区域，进而发挥脊髓再生的作用[23]。腺病毒载体及转基因细胞移植因涉及伦理问题和相关审批制度，故其研究目前多局限于动物模型[24]。因此，经脑脊液注射法被认为是目前最好的移植方法。

3 BMSCs治疗SCI的机制

主要的机制如下，（1）研究显示，BMSCs在某些条件下可诱导分化为胶质细胞和神经元样细胞，填充损伤部位组织，在局部形成神经回路，并能链接到植入体神经网络中，使损伤部位的神经传导得以恢复[25-26]；（2）BMSCs可起到一个细胞桥的作用填充损伤区，提供化学或机械的引导，引导再生神经通过损伤区，完成功能的重建[27]。（3）BMSCs可产生多种神经营养因子，如神经生长因子、脑源性神经营养因子等，这些因子表达上调可促进局部微血管和神经再生，起到损伤修复作用[28]。（4）有学者研究发现BMSCs通过激活多肽（PACAP）基因，进而降低肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等促炎性因子的表达以及增加抗炎性因子的表达来降低损伤部位的炎症反应，促进脊髓横断大鼠损伤局部的组织修复[29]。杨新明等[30]认为BMSCs通过分泌多种抗氧化能力的因子，来抑制氧化应激反应；也可能是通过生成新的血管来改善损伤部位的缺血状况，进而促进神经组织的重建。Hu等[31]研究表明BMSCs移植后可通过分泌生物活性物质白细胞介素-7（IL-7）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）使SCI部位血管再生。

4 BMSCs移植治疗SCI的实验研究

BMSCs移植治疗SCI的动物实验研究有很多。总体来说，治疗效果比较理想，现介绍几例。研究者将导入胶质细胞源性神经营养因子基因的BMSCs进行移植，移植细胞持续表达高水平胶质细胞源性神经营养因子蛋白，可稳定发挥神经营养作用，促进脊髓损伤的修复[32]。Ding等[33]报道电针刺激疗法与过表达TrkC的BMSCs体内移植结合起来，结果局部层粘连蛋白和生长相关蛋白（GAP-43）明显上调，而胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和硫酸软骨素蛋白多糖（CSPGs）则出现了明显下调，示踪发现皮质脊髓束5-HT阳性神经纤维长入并通过损伤部位。Cantinieaux等[34]发现，使用BMSCs的条件性培养基（BMSC-CM）也可以促进SCI后的神经修复，改善动物的运动功能；而Ritfeld等[35]的研究表明，BMSCs移植后可通过促进血管新生及轴突生长来改善大鼠的感觉和运动功能。这些动物研究为BMSCs应用到SCI的临床治疗提供了部分实验依据。

5 BMSCs移植治疗SCI的临床应用

由于目前对于干细胞的临床应用存在比较严格的审核制度，故BMSCs治疗SCI的临床报道比较少。Yazdani等[36]在临床实验中发现，BMSCs移植治疗脊髓损伤安全并且疗效明显。Pal等[37]将体外培养的患者自体BMSCs，注射到30例SCI患者脊髓损伤处，有3例患者随访3年，20例患者随访1～2年。结果发现这些患者均有一定程度的功能恢复且没有明显的副反应。Syková等[38]于2006年将患者自体的BMSCs种植在一种在体内可以降解的移植支架上后，再移植到20例SCI患者体内（7例急性SCI患者，13例慢性SCI患者）。3个月内，5例急性SCI患者和1例慢性SCI患者运动和感觉功能得以恢复，2年内无一例患者出現任何并发症。Moviglia等[39]于2006年报道了将BMSCs转分化为神经干细胞后注射治疗2例慢性SCI患者的临床结果，治疗3个月后，2例患者的运动和感觉功能明显恢复，患者均未出现不良反应。在2008年，Saito等[40]报道了1例人BMSCs应用于SCI的临床试验，患者从高空坠落，C5椎体骨折合并SCI，术后移植自体BMSCs，半年后，患者运动和感觉功能均有明显改善，而且没有免疫反应和副反应。赵廷宝等[41]于2006年报道了8例SCI患者接受自体BMSCs和异体髓鞘细胞联合移植，接受移植的患者术后均无不良反应，其中1例于术后30 d开始出现下肢感觉恢复，其余患者与移植前无改善。还有研究报道，对于慢性期BMSCs移植虽然没有并发症发生，但效果并不明显；对于亚急性期和慢性期SCI的BMSCs自体移植治疗尚需要更多的亚临床实验证实[42]。

6 问题与展望

由于BMSCs具有多向分化能力且易于分离培养及免疫原性低等优点，使其在临床应用方面前景广阔。学者已经在BMSCs移植治疗SCI动物实验上取得了较大的进展，但临床应用才刚刚起步，相信在广大学者的不懈努力下，BMSCs有可能在SCI治疗这一世界医学难题中发挥重要作用，为广大SCI患者带来福音。

参考文献

[1]李建军，杨明亮，杨德刚，等.创伤性脊柱脊髓损伤评估、治疗与康复专家共识[J].中国康复理论与实践，2017，23（3）：274-287.

[2]王鹏，孙桂森，郭隆升，等.急性脊髓损伤的药物治疗[J].医学与哲学（B），2017，38（6）：72-75.

[3]勾丽洁，许世奇，刘旭东，等.早期康复对脊髓损伤患者功能恢复及并发症的影响[J].中国老年学杂志，2014，34（2）：313-315.

[4]孙丽，于丽，张华芳，等.人脐带血间充质干细胞的分离培养及生物学特性[J].解剖科学进展，2011，17（2）：131-134.

[5] Xiao Y，Wang Y，Li L，et al.Homing of chloromethy lbenzoylammonia-lableled bone marrow mesenchymal stem cells in animmune mediated bone marrow failure mouse model in vivo[J].Genet Mol Res，2014，13（1）：11-21.

[6] Forostyak S，Jendelova P，Sykova E.The role of mesenchymal stromal cells in spinal cord injury，regenerative medicine and possible clinical applications[J].Biochimie，2013，95（12）：2257-2270.

[7] Tamir A，Petrocelli T，Stetler K，et al.Stem cell factor inhibits erythroid differentiation by modulating the activity of Glcyclin dependent kinase complexes：a role for p27 in erythroid differentiation compled G1 arrest[J].Cell Growth Differ，2000，11（5）：269-277.

[8]徐亦辰，刘玲珑，赵文婧，等.骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞相关基因表达与形态结构发生的关联[J].中国组织工程研究，2017，21（13）：1974-1979.

[9] Brazerlton T R，Rossi F M，Keshet G I，et al.From marrow to brain：expression of neuronal phenotypers in adult mice[J].Science，2010，290（5497）：1775-1779.

[10]周雪颖，李双月，曲淑贤，等.miR-let-7b慢病毒载体促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化[J].中国细胞生物学学报，2018，40（7）：1146-1152.

[11]郑盛，杨涓，唐映梅.间充质干细胞在炎症免疫调节中的作用及应用进展[J].中国组织工程研究，2015，19（45）：7362-7368.

[12]唐夏泓，陈锋.骨髓间充质干细胞在心搏骤停后脑复苏中的研究进展[J/OL].创伤与急诊电子杂志，2015，3（4）：13-17.

[13] Cho D I，Kim M R，Jeong H Y，et al.Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow derived macrophages[J].Exp Mol Med，2014，46（1）：e70.

[14] Ribeiro A，Laranjeira P，Mendes S，et al.Mesenchymal stem cells from umbilical cord matrix，adipose tissue and bone marrow exhibit different capability to suppress peripheral blood B，natural killer and T cells[J].Stem Cell Res Ther，2013，4（5）：125.

[15]李兰兰，李宁，杨晓菲，等.人脐带间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的免疫原性变化[J].中国组织工程研究，2018，22（13）：2045-2050.

[16]郭德镔，朱向情，潘兴华.骨髓间充质干细胞修复辐射造血损伤的机制[J].中国组织工程研究，2017，21（21）：3407-3413.

[17]陈梓欣，周政，冼绍祥，等.不同注射容积的骨髓间充质干细胞移植对心梗后心衰大鼠的影响[J].中华中医药杂志，2018，33（7）：3061-3065.

[18] Smith J，Plchampally R，Perry A，et al.Isolation of a highly clono genic and multipotential subfraction of adult stem cells from bone marrow stroma[J].Stem Cells，2004，22（5）：823-831.

[19] Shen L H，Li J，Chen J，et al.One year follow up after bone marrow stromal cell treatment in middle-aged female rats with stroke[J].Stroke，2007，38（7）：2150-2156.

[20]鄭盛，杨涓，唐映梅.间充质干细胞在炎症免疫调节中的作用及应用进展[J].中国组织工程研究，2015，19（45）：7362-7368.

[21]马彦，臧爱萍，杨焕凤，等.间充质干细胞在治疗移植物抗宿主病中的应用[J].内科理论与实践，2018，13（2）：124-128.

[22] Ritfeld G J，Rauck B M，Novosat T L，et al.The effect of a Polyurethane based reverse thermal gel on bone marrow stromal cell transplant survival and spinal cord repair[J].Biomaterials，2014，35（6）：1924-1931.

[23] Lu P，Jones L L，Snyder E Y，et al.Neural stem cells constitutively secrete neurotrophic factors and promote extensive hostaxonal growth after spinal cord injury[J].Exp Neurol，2003，181（2）：115-129.

[24]孙佳佳，周军，杨惠林.骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展[J].中华创伤杂志，2015，31（6）：568-570.

[25] Zeng X，Qiu X C，Ma Y H，et al.Integration of donor mesenchymal stem cell-derived neuron-like cells into host neural network after rat spinal cord transection[J].Biomaterials，2015，53：184-201.

[26] Zeng R，Wang L W，Hu Z B，et al.Differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into neuron-like cells in vitro[J].Spine（Phila Pa 1976），2011，36（13）：997-1005.

[27]赵锡武，刘鑫，荣辉，等.神经干细胞和骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤效果与机制对比[J].中国实用神经疾病杂志，2016，19（9）：15-17.

[28]冯婷婷，叶英，许铁.脑脊液诱导的大鼠BMSC是移植对脊髓损伤大鼠神经营养因子分泌的影响[J].中国急救复苏与灾害医学杂志，2015，10（7）：612-615.

[29] Tsumuraya T，Ohtaki H，Song D，et al.Human mesenchymal stem/stromal cells suppress spinal inflammation in mice with contribution of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide（PACAP）[J].J Neuroinflammation，2015，12：35.

[30]杨新明，胡长波，成垚昱.脊髓损伤机制及骨髓间充质干细胞移植治疗机制的研究[J].生物骨科材料与临床研究，2016，13（6）：68-71.

[31] Hu J Z，Long H，Wu T D，et al.The effect of estrogen related receptor α on the regulation of angiogenesis after spinal cord injury[J].Neuroscience，2015，290：570-580.

[32]石良晨，秦峰.膠质细胞源性神经营养因子修饰骨髓间充质干细胞移植与传统方法治疗脊髓损伤研究进展[J].中华实用诊断与治疗杂志，2015，29（5）：423-425.

[33] Ding Y，Yan Q，Ruan J W，et al.Electroacupuncture promotes the differentiation of transplanted bone marrow mesenchymal stem cells overexpressing Trk C into neuron-like cells in transected spinal cord of rats[J].Cell Transplant，2013，22（1）：65-86.

[34] Cantinieaux D，Quertainmont R，Blacher S，et al.Conditioned medium from bone marrow derived mesenchymal stem cells improves recovery after spinal cord injury in rats：an original strategy to avoid cell transplantation[J].Plos One，2013，8（8）：e69515.

[35] Ritfeld G J，Nandoe Tewarie R D，Vajn K，et al.Bone marrow stromal cell mediated tissue sparing enhances functional repair after spinal cord contusion in adult rats[J].Cell Transplant，2012，21（7）：1561-1575.

[36] Yazdani S O，Hafizi M，Zali A R，et al.Safety and possible outcome assessment of autologous Schwann cell and bone marrow mesenchymal stromal cell co-transplantation for treatment of patients with chronic spinal cord injury[J].Cytotherapy，2013，15（7）：782-791.

[37] Pal R，Venkataramana N K，Bansal A，et al.Ex vivo expanded autologous bone marrow derived mesenchymal stromal cells in human spinal cord injury paraplegia a pilot clinical study[J].Cytotherapy，2009，11（7）：897-911.

[38] Syková E，Homola A，Mazanec R，et al.Autologous bone marrow transplantation in patients with subacute and chronic spinal cord injury[J].Cell Transplant，2006，15（8-9）：675-687.

[39] Moviglia G，Fernandez V R，Brizuela J，et al.Combined protocol of cell therapy for chronic spinal cord injury：report on the electrical and functional recovery of two patients[J].Cytotherapy，2006，8（3）：202-209.

[40] Saito F，Nakatani T，Iwase M，et al.Spinal cord injury treatment with intrathecal autologous bone marrow stromal cell transplantation：the first clinical trial case report[J].J Trauma，2008，64（1）：53-59.

[41]趙廷宝，卢兆桐，赵凌云，等.骨髓间充质干细胞与嗅鞘细胞联合移植治疗脊髓损伤的早期观察[J].中国矫形外科杂志，2006，39（3）：346-348.

[42] Bhanot Y，Rao S，Ghosh D，et al.Autologous mesenchymal stem cells in chronic spinal cord injury[J].Br J Neurosurg，2011，25（4）：516-522.

（收稿日期：2018-05-15） （本文编辑：董悦）