粪样保存方法对黑白仰鼻猴肠道结节线虫监测的影响

李延鹏，黄志旁，刘硕然，杨毅梅，钟 泰，苏锡钧 ，崔亮伟，肖 文*

（1.大理大学东喜玛拉雅研究院，云南大理 671003；2.云南省中国三江并流区域生物多样性协同创新中心，云南大理 671003；3.白马雪山国家自然保护区管理局，云南迪庆 674609；4.西南林业大学，昆明 650224）

寄生虫病是危害人类、牲畜和家禽健康的主要疾病之一〔1-2〕。在占世界总人口数量77%以上的广大发展中国家，特别是在热带和亚热带地区的发展中国家寄生虫病广泛流行，威胁着儿童和成人的健康和生命〔3-4〕。因此，寄生虫病的危害仍是普遍存在的公共卫生问题〔5〕。作为发展中国家的人口大国，中国幅员辽阔，地跨寒、温、热三带，自然条件差别很大，人民生活习惯复杂多样，使我国成为寄生虫病严重流行的国家之一，特别是在广大农村，寄生虫病一直是危害人民健康的常见疾病。疟疾、血吸虫病、丝虫病、黑热病和钩虫病，曾被称为“五大寄生虫病”，夺去过成千上万人的生命，严重阻碍农业生产和经济发展〔5〕。

从粪便中检出寄生虫虫卵，是诊断肠道寄生虫病的常用方法〔6-7〕，但是寄生虫虫卵的发育时间较短，故其镜检时都要求使用新鲜粪便样品〔8〕。在人体寄生虫检测时粪便样品可及时获得，但是对于野生动物而言，在检测时及时获得粪便样品就存在较大难度，甚至是不可能实现的。为了保持粪便样品中的原虫形态及抑制虫卵的发育，应立即对粪便进行固定保存。在寄生虫诊断医学中，有多种的粪便样品保存方法，最常用保存方法可分为利用保存剂进行保存和低温保存两种，常用的保存剂有福尔马林、硫柳汞-碘-甲醛溶液（MIF）、肖氏固定液（Schaudinn's fluid）和聚乙烯醇〔9-11〕，低温保存主要是冷冻保存。

针对野生动物的寄生虫研究，其主要介质为血液、组织或粪便样品〔12〕，而针对活体的野生动物而言血液和组织样品是很难获得的，因此活体野生动物的研究往往只能依托粪便介质进行。但目前尚没有针对野生动物粪便寄生虫检测的粪便样品保存方法比较研究的报道，为此本文针对白马雪山国家级自然保护区黑白仰鼻猴的寄生虫感染现状，进行了粪便中结节线虫（Oesophagostomumsp.）检测样品的保存方法对比研究。

1 实验材料与方法

1.1 研究地点研究地点位于云南省西北部的白马雪山国家级自然保护区境内。白马雪山国家级自然保护区在行政区上，地跨德钦县的升平镇、奔子栏镇、霞若乡和维西县的巴迪乡、叶枝乡、康普乡、白济讯乡、攀天阁乡和塔城镇。地处北纬27°24＇～28°36＇，东经98°57＇～99°25＇之间，属横断山脉东部云岭的一部分，是“三江（金沙江、澜沧江、怒江）并流”地区，也是青藏高原向云贵高原的过渡地带，自然地理环境极为复杂。见图1。

图1 研究地点

1.2 实验材料福尔马林保存液：在100 mL的甲醛（AR级）溶液中加入900 mL的0.85%的NaCl溶液，然后加入0.80 g的混合药品（6.10 g的Na2HPO4和0.15 g的NaH2PO4充分混合）〔13-14〕。

粪便样品：现场采集的黑白仰鼻猴新鲜粪便样品18份，粪便样品供体为保护区南片的塔城镇响姑箐黑白仰鼻猴猴群，该群由8个OMU（one male unit繁殖单元，即一雄多雌单元）和1个AMU（all male unit，即全雄单元）组成，共90个个体，所有成年个体均能个体识别。粪便样品采集时将同一个体的所有粪便颗粒进行采集，记录粪便样品供体信息后放入自封袋中。

1.3 样品保存将采集的样品在1 h内带回野外基地实验室，每份样品称量后分成2份（每份30 g），分别放入样品管内进行分两组保存，其中A组加入福尔马林保存液保存并将其放置实验室阴凉通风处，B组直接放入-20 ℃冰箱保存〔8〕，A、B两组各18个样品。

1.4 粪便寄生虫虫卵镜检及计数在取样当天至第7天每天分别对A、B组取样进行实验，之后第10天，第15、20、30天对A、B组分别取样实验，如检出强度下降至30%以下则停止检测。

实验方法为饱和硫酸锌漂浮法。A、B组分别称取1 g（±5%）粪样置于50 mL烧杯中，加至20 mL的无菌水搅拌混匀后，经50目网筛过滤，将滤液置20 mL的离心管中，1 500 r∕min，离心5 min，去上清液，加饱和硫酸锌溶液至 5.0 mL，摇匀，待用〔8，11，15-16〕。用滴管吸取适量样品至麦克马斯特虫卵计数板计数室内，40倍物镜下镜检计数，每样重复计数4次后取平均值计算出检出强度〔17-18〕，最后得出每克粪便的虫卵数量。

检出率=（检验结果为阳性样本数∕总样本数）×100%

检出强度（每克虫卵数量）=计数室的虫卵总数×（计数室容积0.10 mL ∕5.0 mL）

1.5 数据分析采用配对t检验分析-20℃冷冻和福尔马林保存液保存黑白仰鼻猴粪便的结节线虫检出强度差异；采用χ2检验分析两种保存方法对黑白仰鼻猴粪便结节线虫检出率的差异。所有数据用Excel软件处理，利用SPSS软件进行统计分析显著水平设为0.05。

2 结果

两种方法保存黑白仰鼻猴粪便样品的结节线虫虫卵检出率有差异，-20℃冷冻保存下结节线虫虫卵的检出率高于福尔马林保存液保存法（χ2=45.10，P＜0.01）。-20℃冷冻保存结节线虫虫卵的检出率是88.89%（56∕63）；福尔马林保存液保存下结节线虫的检出率是30.16%（19∕63）。

两种方法保存的黑白仰鼻猴粪便样品结节线虫虫卵的检出强度存在差异，-20℃冷冻保存下粪便结节线虫的检出强度高于福尔马林保存液保存（t=6.799，P＜0.001，df=62）。-20℃冷冻保存下结节线虫的检出强度为（919.69± 916.09）个∕g，福尔马林保存液保存下结节线虫的检出强度为（106.62±212.46）个∕g。见图2。

同时两种方法保存粪样的结节线虫虫卵检出强度随保存时间增加出现差异，在第4天，福尔马林保存液保存的粪便样品结节线虫的检出强度出现下降，而冷冻保存下的粪便样品结节线虫的检出强度在1～10 d一直维持在较为稳定的检出强度。两种保存方法下，前3 d的结节线虫检出强度无差异，第4～10天开始出现差异，差异在第5天达最大。见表1。

图2 不同保存方法及保存时间下黑白仰鼻猴粪便样品中结节线虫检出强度

表1 虫卵检出强度随保存时间（1～10 d）的变化

在两种方法保存效率出现显著差异之后，继续对-20℃冷冻保存条件下的样品进行了保存时间的验证，结果显示，结节线虫的检出率1～30 d的保存时间内没有下降（88.89%），平均检出强度维持在65%（973.89～633.03 个∕g）。见图3。

图3 -20℃冷冻保存1～30 d黑白仰鼻猴粪便样品的结节线虫虫卵的检出率和检出强度

3 讨论

本文首次以结节线虫为例对黑白仰鼻猴粪便样品在-20℃冷冻保存与福尔马林保存液保存的保存效果进行了对比研究，通过对两种保存条件下不同保存时间内粪便样品中的结节线虫的检出强度及检出率的比较，发现在-20℃冷冻保存条件下的粪便样品保存效果明显好于福尔马林保存液。-20℃冷冻保存的检出强度一直到第10天都维持在60%，30 d内维持在50%；在福尔马林保存液条件下的粪便样品在保存第3天之后结节线虫的检出强度就下降至4.98%；检出率上冷冻保存的样品30 d内并没有下降，而福尔马林保存液保存样品检出率最低下降至30.16%，因此针对结节线虫的粪便样品冷冻保存效果更好，可以维持较高的检出率及检出强度，同时保存时间更加长久〔19〕。针对研究野生动物等不易及时获得粪便样品的对象时，粪便样品的保存是一个极为重要的步骤，当粪便样品保存不当将会对实验结果产生较大的影响〔17〕。相对其他的液体保存剂而言，用福尔马林保存液保存粪便样品，固定后的样品可以用于一些免疫学检验，短时间内对于镜检检出率还是有一定的保证。但是相对于冷冻保存而言，福尔马林溶液保存的粪便样品在检出强度上存在不稳定性，因而对于定量的研究而言应尽量选用低温保存，且福尔马林溶液保存粪便样品在保存过程中会因为溶液与虫卵内的渗透压差产生变形对后期的镜检结果产生很大的影响，同时福尔马林溶液对保存滋养体而言效果也很不理想。

冷冻保存的时间一般也不建议过久，过久之后部分虫卵也会因为失水导致破裂，本研究低温冷冻保存在30 d内对结节线虫虫卵的检出强度及检出率影响都较小，故在针对野生动物的粪便寄生虫检验研究中可以利用低温保存法保存粪便样品。近期车载冰箱已经较为普遍，可以事先冷冻好冰袋置于便携式车载冰箱内，将获取的野生动物粪便用取样管分装好，置于有冰袋的便携式车载冰箱内，并带回车上，尽快送回实验室进行检验，就可实现样品的短期低温保存，并能有效的抑制寄生虫虫卵的发育，经过长期的野外试验作者已经证实该方法的可行性。

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