高效液相色谱法测定红豆杉中紫杉醇及多烯紫杉醇的含量

周 斌，周 美，王道平＊，杨小生，王俊杰

（1．贵州健康职业学院，铜仁554300； 2．铜仁市食品药品检验所，铜仁554300；3．贵州省中国科学院 天然产物化学重点实验室，贵阳550002； 4．毕节医学高等专科学校，毕节551700）

红豆杉（Taxus）是国家一级保护野生珍稀抗癌植物，其主要含有芳香烃类、二环紫杉烷类、木脂素类及黄酮类等化学成分［1－2］，其中紫杉醇由于具有较好的抗癌活性而成为研究热点。红豆杉的树皮、枝叶、根部，甚至种子均可提取紫杉醇［3］，多烯紫杉醇是在对紫杉醇结构改造过程中合成出来的紫杉醇衍生物［4］，主要用于乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌等多种实体肿瘤的治疗，疗效显著，是继紫杉醇后又一种新型抗微管药物。在体外抗癌活性试验中，多烯紫杉醇活性可达紫杉醇的10倍，体内的亲和性为紫杉醇的2倍。除此之外，多烯紫杉醇还具有生物利用度好、抗癌更广谱及更好的水溶性、细胞内浓度更高、毒副作用小的特点，与某些抗肿瘤药物联合使用时，还具有协同抗肿瘤作用［5］。许多体外和临床研究均证实多烯紫杉醇对多种肿瘤细胞有放射增敏作用且不加重正常组织的放射损伤［6－7］。本工作以紫杉醇和多烯紫杉醇为指标，采用高效液相色谱法对红豆杉雄性叶、枝皮，雌性叶、枝皮、绿色果肉、红色果肉等不同部位进行了系统深入研究，研究结果可为红豆杉的深度开发利用提供一定科学基础。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

Agilent 1100型高效液相色谱仪，配四元泵、在线脱气机、自动控温自动进样、柱温箱、DAD检测器、色谱工作站；AG 285型十万分之一天平；KQ－3000型数控超声波清洁器；N－1001型旋转蒸发仪；SB－2000型水浴锅。

混合对照品储备溶液：取紫杉醇和多烯紫杉醇标准物质，精密称定，用乙腈溶解并定容，配制成紫杉醇和多烯紫杉醇质量浓度分别为388．0，940．0mg·L－1的混合对照品储备溶液。

红豆杉采自贵州省湄潭县，紫杉醇、多烯紫杉醇标准物质（纯度均大于98%），甲醇、二氯甲烷、正己烷均为分析纯，乙腈为色谱纯，水为纯净水。

1．2 仪器工作条件

Gemini－NX C18色谱柱 （250mm×4．6mm，5μm）；柱 温 30 ℃；检 测 波 长 227nm；流 量1．0mL·min－1；进样量10．0μL，流动相A为水，B为乙腈。梯度洗脱程序：0～10min时，B由40%升至50%；10～13min时，B由50%升至53%；13～25min时，B由53%升至73%；25～27min时，B由73%降至40%，保持3min。

1．3 试验方法

将红豆杉按叶、枝、皮等不同部位分类放入烘箱，于50℃干燥后粉碎，过孔径0．85mm筛，称取2．000 0g置于锥形瓶中，加入甲醇－二氯甲烷（1＋1）混合液35mL浸泡18h后，超声30min，过滤，滤渣用甲醇冲洗，合并滤液，用旋转蒸发仪在30℃水温下回收滤液的溶剂，残渣用20mL水转移至分液漏斗中，用30mL正己烷萃取，弃去上层液，萃取3次后，水层用30mL二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷萃取液，用旋转蒸发仪回收二氯甲烷，残渣用甲醇转移 至 5mL 容 量 瓶 中 并 定 容，混 匀［8－9］，用0．45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液，按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2．1 色谱行为

按仪器工作条件对混合对照品溶液进行测定，色谱图见图1。

图1 混合对照品溶液的高效液相色谱图Fig．1 HPLC chromatogram of mixed reference solution

2．2 提取条件的选择

试验中所用样品均为红豆杉老树大皮，所用的色谱条件是根据《中国药典》2010年版二部中紫杉醇的有关物质的检测色谱条件［10］优化而得，通过单因素考察和正交试验后最终确定了提取方法。

2．2．1 浸泡时间

在其他试验条件相同的情况下，试验考察了浸泡时间分别为1，6，12，18，24，30h时的浸泡效果。结果表明：浸泡时间为24，30h时均达到最大浸泡效果。

2．2．2 甲醇－二氯甲烷体积比

在其他试验条件相同的情况下，试验考察了浸泡液甲醇与二氯甲烷体积比分别为3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3时的浸泡效果。结果表明：甲醇与二氯甲烷的体积比为1∶1，即甲醇－二氯甲烷（1＋1）混合液的浸泡效果较好。

2．2．3 超声时间

在其他试验条件相同的情况下，试验考察了超声时间分别为10，15，30，45，60min时的提取效果。结果表明：超声时间为30min时提取效果较好。

2．2．4 二氯甲烷萃取体积

在其他试验条件相同的情况下，试验考察了二氯甲烷萃取体积分别为10，20，30，40，50mL时的萃取效果，结果表明：二氯甲烷萃取体积为30mL时萃取效果较好。

影响红豆杉中紫杉醇和多烯紫杉醇提取的主要因素有浸泡时间、甲醇－二氯甲烷体积比、超声时间、二氯甲烷萃取体积，各取3个水平，进行L9（34）正交试验，以综合K值为评价指标，筛选出最佳提取条件，见表1。

表1 正交试验表Tab．1 Orthogonal experiment

由表1可知：浸泡时间18h，甲醇与二氯甲烷的体积比1∶1，即甲醇－二氯甲烷（1＋1）混合液，超声时间30min，二氯甲烷萃取体积30mL为最佳提取条件。

2．3 标准曲线及检出限

逐级稀释混合对照品储备溶液，制得5个不同质量浓度的混合对照品溶液，按仪器工作条件进行测定，以对照品的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归。结果表明：紫杉醇和多烯紫杉醇的线性范围分别为0．19～97．00mg·L－1，0．46～182．40mg·L－1；线性回归方程分别为y＝10．77x＋3．335，y＝7．140x＋3．386；相关系数均为0．999 9。

对质量浓度最低的溶液逐级进行稀释，以3倍信噪比计算方法的检出限（3S／N），10倍信噪比计算测定下限（10S／N）。结果表明：紫杉醇和多烯紫杉醇的检出限分别为0．06，0．02mg·L－1，测定下限分别为0．13，0．10mg·L－1。

2．4 精密度、稳定性和重复性试验

取19．4mg·L－1紫杉醇和45．6mg·L－1多烯紫杉醇的混合对照品溶液，重复测定6次，结果表明：紫杉醇峰面积的相对标准偏差（RSD）为0．62%，多烯紫杉醇峰面积的RSD为0．71%，说明精密度较好。

取供试品溶液，分别于0，4，8，12，16，24h进样测定，结果表明：紫杉醇峰面积的RSD为0．83%，多烯紫杉醇峰面积的RSD为1．3%，说明供试品溶液在24h内稳定。

取红豆杉老树大皮样品，共6份，分别按试验方法制备供试品溶液，进样测定。结果表明：紫杉醇的质量分数为0．139 5g·kg－1，测定值的 RSD 为1．2%，多烯紫杉醇的质量分数为0．001 8g·kg－1，测定值的RSD为1．4%，说明方法的重复性较好。

2．5 回收试验

取各对照品储备溶液适量，稀释成不同浓度水平的混合对照品溶液，称取已知含量的红豆杉样品6份，每份2．000 0g，分别加入一定量的上述混合对照品溶液，按试验方法处理样品后进行测定，结果见表2。

2．6 样品分析

取红豆杉粉末样品，按试验方法制备供试品溶液，在仪器工作条件下进样，记录各色谱峰面积，计算各样品中紫杉醇和多烯紫杉醇的含量，结果见表3，其中“－”表示该化合物未检出。

表2 回收试验结果（n＝6）Tab．2 Results of test for recovery（n＝6）

表3 样品分析结果Tab．3 Analytical results of samples

本工作通过对提取过程中的浸泡时间、甲醇－二氯甲烷的体积比、超声时间、二氯甲烷萃取体积进行筛选，得出最佳提取条件，采用高效液相色谱法同时对红豆杉中紫杉醇和多烯紫杉醇的含量进行测定。方法简便、快速，重现性好，结果准确，可为进一步研究红豆杉的质量控制提供数据支持。

［1］ 袁遥，刘佳佳，陈淑娟，等．红豆杉内生真菌代谢产物的分离与鉴定［J］．中南林业科技大学学报，2010，30（5）：101－105．

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［3］ 王玉震，仝川，柯春婷．红豆杉植株紫杉醇含量研究进展［J］．亚热带植物科学，2008，37（4）：59－63．

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［5］ 史筱倩．多西他赛不良反应及分析［J］．中国医药导报，2009，6（6）：90－91．

［6］ 杨孝来．紫杉醇与多烯紫杉醇［J］．实用药物与临床，2010，13（4）：281－283．

［7］ 李鹏，李春香，李想．多烯紫杉醇的合成工艺研究［J］．中国药物化学杂志，2009，19（5）：356－360．

［8］ 卢建伟．加拿大红豆杉中紫杉醇提取分离工艺及含量测定研究［D］．长春：吉林农业大学，2007．

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［10］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典二部［M］．北京：中国医药科技出版社，2010．