血小板型12-脂氧合酶促进小鼠上皮细胞JB6 P+的增殖

周 婷，王 莹，乔 丹，朴英实*

（延边大学医学院肿瘤研究中心，吉林 延吉 133002）

血小板型12-脂氧合酶（Platelet 12- lipoxygenase,p12-LOX）是脂氧合酶家族中重要的一员[1]，并在结肠癌、肝癌、卵巢癌等肿瘤组织中高表达[2]。研究表明，p12-LOX在肿瘤中的高表达，与肿瘤发生发展有密切相关，主要通过诱导血管内皮生长因子表达、促进细胞增殖发挥重要作用。p12-LOX的选择性抑制剂黄芩素（Baicalein,BAI）取自黄芩根部，具有抗炎、抗氧化、抗病毒的作用，且通过抑制肿瘤细胞的增殖、诱导凋亡、阻滞细胞周期于G0/G1期发挥着抗肿瘤的作用[1]，还是一种理想的抗肿瘤药物。小鼠上皮JB6 P+细胞来源于JB6 P-细胞，并在肿瘤刺激物的作用下转化为启动化的细胞，具有癌前病变的特性。本文着力于研究p12-LOX及其选择性抑制剂BAI对小鼠上皮JB6 P+细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及形态学观察

小鼠上皮JB6 P-细胞和JB6 P+细胞来自于美国模式菌种保藏中心，细胞培养于含有5%胎牛血清的MEM细胞培养液，并放置在5%CO2和37℃的恒温箱中。取对数生长期的细胞用倒置相差显微镜观察其形态。

1.2 逆转录-聚合酶链反应（Reverse transcription PCR，RT-PCR）

对数生长期的细胞用TRIzol试剂提取总RNA，并用反转录酶Superscript III将总RNA反转录成cDNA，cDNA为模板用RT-PCR试剂盒进行PCR扩增。引物序列如下：p12-LOX，上游序列5’-GCGGTCTTCGAATTGAACTT-3’和下游序列5’-CAGGAACAGTGTTGGAGCTG-3’；β-actin：上游序列5’- GAAGAGCTAC GAGCTGCCTGA-3’和下游序列5’- CAGACAGCACTGTGTTGGCG-3’。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像系统进行拍照。

1.3 MTT（噻唑蓝）细胞增殖实验

对数生长期的JB6 P+细胞接种于96孔培养板，每孔102和103个细胞并过夜培养，次日每孔加入0.2 L的5 mmol/L的BAI处理细胞（BAI组），对照组加入同等体积的二甲基亚砜（DMSO），每组设4个复孔。培养细胞4天、6天时每孔加入10 L的5 mg/mL的MTT溶液继续培养4 h，形成的蓝色甲瓒结晶用DMSO溶液溶解（每孔加入100 L），用全波长酶标仪测定570 nm的吸光度值（OD）并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=实验组OD/空白对照组OD×100%。

1.4 单细胞克隆形成实验

对数生长期的JB6 P+细胞常规消化并制备成10个细胞/ml的细胞悬液，并100 L细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，使每孔有一个细胞，用0 mol/L和5 mol/L的BAI分别处理细胞14天，克隆形成后用Gimsa染色液进行染色并计算克隆形成率。克隆形成率（%）=单克隆形成数目/96×100%。

1.5 统计学方法

本实验中所有实验均独立重复三次。采用SPSS17.0和GraphPad Prism 5软件对实验数据进行统计分析。计量资料以表示；多组间数据的比较采用方差分析，组内两两比较采用LDS-t检验；2个独立样本间的比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 显微镜下JB6 P+细胞间连接松散

镜下JB6 P-细胞与细胞连接紧密呈栅栏状，而JB6 P+细胞与细胞间连接松散，无规律且有扩散趋势。见图1A。

2.2 JB6 P+细胞中的p12-LOX mRNA表达高于JB6 P-细胞

RT-PCR检测结果显示，p12-LOX的mRNA水平在JB6 P-细胞中微弱，而在JB6 P+细胞中的表达强烈，明显高于JB6 P-细胞中的表达。见图1B。

2.3 p12-LOX选择性抑制剂BAI抑制细胞增殖

MTT细胞增殖实验结果显示，BAI可显著抑制JB6 P+细胞的增殖（均P＜0.01），在10*3个细胞/孔密度时的增殖率分别为第4天时54.24%±2.67和第6天时70.27%±3.62，而在10*2个细胞/孔密度时的增殖率分别为第4天时8.91%±0.34和第6天时2.28%±0.17，在细胞密度低的条件下BAI对细胞增殖的抑制率更为显著。见表1。

2.4 BAI抑制JB6 P+细胞的单细胞克隆形成

单细胞克隆形成实验结果显示，对照组的单细胞克隆形成率为53.82%±4.92，而5mol/L的BAI组为2.08%±1.80，BAI显著抑制了JB6 P+细胞的单细胞克隆形成（P＜0.01）。见图2。

表1 BAI对JB6 P+细胞增增殖率的影响（x±s）

3 讨 论

p12-LOX在多种癌组织中高表达，可通过抑制细胞凋亡、诱导细胞存活、和促进血管生成促进肿瘤的发展，而BAI作为p12-LOX的选择性抑制剂可促进肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡。研究表明，5～50 mol/L的BAI处理胃癌MGC-803细胞可使凋亡小体增加，说明BAI诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖。胃癌MKN-28细胞中p12-LOX mRNA呈高表达，用25～100 mol/L的BAI处理细胞可呈浓度及时间依赖性地抑制细胞增殖。本研究结果也表明，JB6 P+细胞中p12-LOX的mRNA表达水平高于JB6 P-细胞中的表达，BAI可显著抑制JB6 P+细胞的增殖和单细胞克隆形成，尤其在细胞密度减少到10*2时。这些结果表明，p12-LOX对小鼠上皮JB6 P+细胞具有促进增殖的作用，尤其对低密度细胞的增殖具有重要的作用。

综上所述，p12-LOX具有促进小鼠上皮JB6 P+细胞增殖的作用，尤其促进单个或低密度细胞的增殖。

[1] 金京春,叶 晶,蔡洙哲.血小板型12-LOX抑制剂黄芩素抑制胃癌MK-28细胞增殖和迁移[J].肿瘤,2016,36(2):173-180.

[2] Klampfl T,Bogner E,Bednar W,et al.Up-regulation of 12(S)-lipoxygenase induces a migratory phenotype in colorectal cancer cells[J].Exp Cell Res,2012,318(6):768-778.