脊髓损伤的代谢组学研究进展

1.兰州大学第二医院，甘肃兰州市730000；2.兰州军区兰州总医院全军骨科中心，甘肃兰州市730050；3河南省荣军医院，河南新乡市453000

脊髓损伤是脊柱骨折的严重并发症之一。脊髓损伤可能导致永久性的机体运动和感觉功能障碍，且由于脊髓损伤后发生一系列复杂的病理生理变化，目前难以治愈；同时长期卧床及功能丧失也会导致多种严重并发症，治疗及护理花费巨大，对家庭造成严重的精神及经济负担[1-3]。虽然随着医学的发展，严重脊髓损伤导致的死亡率明显降低，但致残率依然很高，绝大部分患者终身瘫痪。

当前反映脊髓损伤预后的指标主要有临床功能评定和磁共振检查等间接手段，一些生化指标如乳酸脱氢酶、蛋白激酶C、血清内皮素等也用于预后判断，但特异性均较差[4-5]。根据脊髓损伤后的即时美国脊柱损伤协会(American Spinal Injury Association,ASIA)分级来预测神经系统恢复情况并不完全可靠[6]，目前尚缺乏能直接反映脊髓损伤严重程度及判断其预后的特异性生物标志物。对于患者而言，他们最关心的是感觉及运动功能是否能够恢复，鉴定一组能够准确预测个体神经、功能恢复能力的生物标志物对这些患者的康复以及临床医生的治疗具有重大的意义。

代谢组学是通过考察生物体系(细胞、组织或生物体)受刺激或扰动后(如将某个特定的基因变异或环境变化后)其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系代谢途径的一门学科[7-8]。代谢组学研究生物体在疾病或环境刺激下的整体应激和变化，通过分析个体应激后代谢物的变化，更好地理解疾病的病变过程及机体内代谢途径的改变[9]。运用代谢组学的方法了解脊髓损伤后的病理生理过程，找出能够用于辅助诊断或判断预后的特异性生物标志物，伤后早期对脊髓神经损伤程度和可能的预后做出准确判断，能够为临床治疗提供重要的参考依据，帮助临床医生制定最佳的治疗及康复方案。

本文旨在综述脊髓损伤和代谢组学的研究现状以及代谢组学在脊髓损伤方面的研究进展，以期为脊髓损伤的进一步研究提供帮助。

1 脊髓损伤的研究现状

脊髓损伤分为两类：横断伤和挫伤(钝性损伤)[10-11]。这两种类型损伤都会导致血脑屏障的破坏，对脊髓组织产生原发或继发性的损伤，最终导致脊髓细胞死亡或凋亡。血脑屏障的破坏导致炎症细胞进入脊髓组织，浸润的白细胞和常驻的小胶质细胞释放蛋白水解酶、氧化酶、活性氧和一系列促炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子 α (tumor necrosis factor α,TNF-α)[12-13]。急性期促炎分子的峰值可以在受伤后24 h内在人血中测量到[14-17]。但是由于急性期机体应激反应比较大，所以此时出现的变化可能是机体对于创伤的全身反应的结果，而不是脊髓损伤本身。在进行脊髓损伤的实验研究时，通过对建立的动物模型设置“假手术组”与“脊髓损伤组”进行对比，有助于分辨哪些物质与脊髓损伤本身相关。

急性期炎症反应导致损伤原发部位及周围组织发生继发性损害，将进一步加重机体的神经功能障碍。此外，胶质细胞的激活在脊髓损伤的继发性损伤中也起很大的作用。星形胶质细胞活化后合成细胞外基质，包括勿动蛋白A(Nogo protein-A,Nogo-A)、神经硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycan,CSPGs)、少突胶质细胞-髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte-myelin glycoprotein,OMgp)及髓鞘相关糖蛋白(myelin-associated glucoprotein,MAG)等，有大量文献证实，Nogo-A、CSPGs、OMgp和MAG可以在体外抑制轴突生长和在体内抑制轴突再生，并且在临床前研究中，无论是针对单一分子还是针对几种分子组合的治疗均可促进脊髓损伤的神经功能恢复[18-23]。

目前对于脊髓损伤治疗的研究主要从两方面入手[24]，一是神经保护治疗，通过低温、手术减压[25]，应用粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)[26]、糖皮质激素、利鲁唑[27]等，以减轻机械损伤、神经毒性反应、氧化应激对脊髓神经细胞的损害，从而抑制神经细胞凋亡，减轻神经细胞损伤；二是神经再生治疗，包括髓磷脂相关抑制剂靶向剂和成体细胞移植，通过促进神经细胞的再生而恢复神经功能。

虽然文献报道了许多治疗脊髓损伤的新方法，但由于建立临床试验来证明这些方法的安全性和有效性相当困难，所以临床上并不会轻易将新疗法应用于患者。目前临床上对脊髓损伤的治疗仍然以传统的方法为主，即手术复位脊柱骨折，解除对脊髓的压迫，重建脊柱稳定性，同时配合保守治疗，减轻脊髓水肿、缺血、炎性应激等反应。但是，无论用什么方法，治疗的最终目的均在于尽可能多地保留脊髓的神经功能，避免继发性损伤，提高患者的生存率和生活质量。然而，对于脊髓损伤后的病理生理机制尚未完全清楚，现有的针对继发性损伤过程的治疗效果也相当有限，一些新方法也尚未被应用于临床，关于脊髓损伤的治疗仍然是一个世界性的难题。因此，一组能够用于辅助诊断及判断预后的生物标志物的发现，将有可能使脊髓损伤的治疗产生重大突破。

2 代谢组学概述

代谢组学作为基因组学、转录组学、蛋白质组学的重要补充，在短短数年内取得了飞速的发展。代谢组学已经被广泛用来进行特异性生物标志物的寻找以及疾病病理生理机制的研究，并与其他组学技术联合，以求能够阐明疾病的发病机制，从病理代谢过程的角度揭示疾病发生发展的规律，从而积极有效地评价病情，制定最佳的治疗方案[8-9,28]。代谢组学常用的分析技术包括核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)、色谱、质谱、气相色谱串联质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、液相色谱串联质谱(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)等，代谢组学可以对某个或某类相关的特定化合物进行靶向筛选，也可以对样品中所有代谢产物进行无偏向性的非靶向筛选。

相比较基因组学和蛋白质组学，代谢组学的优点比较突出。首先，代谢组学检测的是最终的代谢产物，基因和蛋白质表达的微小变化都会在代谢上得到放大，从而更容易检测；其次，代谢组学研究不需要建立全基因组测序的数据库，只需要代谢物的数据库，而且机体代谢物的种类也远远少于基因和蛋白质的数量，工作量大大减少；最后，代谢组学的研究技术更通用，只需要对样品进行不同的预处理，就可以满足液态、固态等不同性质或不同种类样品的检测[29]。

然而代谢组学技术也有一定的不足。样品中残留的酶解反应和氧化还原反应均会对结果产生一定影响，而且目前尚没有一种能够适合所有代谢物的提取方法；虽然GC-MS有商品化的质谱图库，但还是有相当数量的代谢物或其衍生化产物的质谱图未包含其中，对这部分代谢物的鉴定仍比较困难。尽管现在代谢组学的技术还尚不完善，但是可以通过一系列的设计尽量将误差降到最低。目前最佳的检测方案是先使用非靶向的方法对样品中代谢物进行整体的分析、辨认，避免研究的方向性错误，再利用靶向的方法对结果进行具体的分析、验证，可以保证最大程度检测出需要的所有代谢物，并提高检测的准确性。

3 代谢组学在脊髓损伤中的应用

脊髓原发性损伤或继发性损伤最终导致脊髓神经细胞死亡或凋亡，随着这些死亡或凋亡脊髓细胞的破裂，一些在神经组织损伤的指标中具有特异性的物质也同时被释放，释放到脑脊液或血液中的特异性物质可以提供大量关于脊髓损伤的生物学反应的信息[30]。目前已有研究报道，神经丝蛋白(neurofilament protein,NF)[31]、牛磺酸(taurine,Tau)[32]、神经元特异性烯醇化酶(neuronspecific enolase,NSE)[33]、 钙 结 合 蛋 白 S100 β (calcium binding protein S100 β,S100 β)[33]和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)[31]等物质首先被释放到脑脊液中，然后吸收入血，所以在损伤局部和全身均可检测到，而且能够反复检测，动态了解个体的脊髓神经损伤进展或恢复情况，快速判断患者对当前治疗的反应，从而了解当前治疗对于该患者是否有效。这些物质在脑脊液或血液中的量或许与脊髓神经损伤的严重程度直接相关，通过对体液中这些物质的检测，能够更准确判断病情，避免延误治疗时机而造成不可逆的后果。

有关脊髓损伤的生物标志物，绝大多数研究都是建立在对特定目的蛋白的假设上。Shaw等[34]提出，由于NF在神经元中的丰度很高，因此检测脑脊液或血清中的NF极有可能指示神经元损伤。在NF的三种亚基，即轻(Light,L)、中(Middle,M)、重(Heavy,H)中，磷酸化的NF-H，由于其对蛋白降解酶的相对抗性，被认为可能是神经损伤后在血清或脑脊液中最容易检测到。这个假设为后来更深入地研究奠定了基础，用以评估脊髓损伤后这种生物标志物的潜在价值。然而，很少有研究鉴定脊髓损伤的新生物标志物。

Lubienicka等[35]使用高通量无标记液相色谱-质谱/质谱蛋白组学定量技术，比较了脊髓损伤后24 h大鼠的脑脊液，确定了42个具有潜在价值的生物标志物，其中10个标志物可能提示了脊髓损伤的严重程度。Sengupta等[36]采用无偏倚的蛋白组学定量的方法，使用差异凝胶电泳和质谱分析技术比较脊髓损伤后1～8 d患者的脑脊液，鉴定了8种在脊髓完全和不完全损伤患者的脑脊液中差异表达的蛋白质。Xu等[37]通过脂质组学分析技术评估脊髓组织中含有的多不饱和脂肪酸的磷脂酰胆碱，发现其中一种磷脂酰胆碱的空间表达与反应性小胶质细胞和星形胶质细胞的活性相匹配，这些脂质组学分析可以阐明脂质代谢的作用以及脊髓损伤后细胞膜的损伤情况。但是这些结果尚不能用于临床，还需要对脊髓损伤患者的脑脊液或血液进行代谢组学的研究来验证其作为生物标志物的价值，因为代谢组学代表了基因、转录和蛋白质相互作用的终点，更能反应脊髓损伤后的病理生理变化；对脊髓损伤患者脑脊液或血浆中这些代谢物的分析也可以用来判断在大鼠实验中的这些发现是否同样适用于人类。

Kuhle等[38]以健康人群作为对照，研究血清NF-L作为人类脊髓损伤严重程度和预后生物标志物的价值，这些健康个体不可能显示出任何异常的系统生物学反应，因此，损伤组和对照组之间观察到的一些差异很可能与脊髓损伤本身无关。即使能够筛选出相同水平和类型的无脊髓损伤表现的创伤患者以及匹配的患者人口数，但是不可能保证对脊髓组织没有任何的损伤。人类脊髓损伤的原因多种多样，表现复杂多变，因此，可以认为干预的动物模型为脊髓损伤相关生物标志物的研究提供了便利。目前已经产生了几种不同的动物模型。

脊髓损伤的原因主要有两类：锐器伤和挫伤。在动物模型中，挫伤最常见的是使用脊髓击打器[39]，经过校准的重物落下砸在暴露的脊髓上，这种装置可以通过改变所使用的重力的大小而造成不同程度的损伤。但这种方法造成的损伤并不稳定，需要大量预实验来确定击打的力度。另外一种新型的制造脊髓挫伤模型的方法是钳夹法，使用动脉夹或标准钳在设定的时间内压迫脊髓，从而达到损伤的效果[40]。而为了研究完全性损伤，通常需要使用手术剪或手术刀片切割离断所有脊髓束，并且抽吸检查是否造成了完全性损伤[41]。

动物模型是高度可控的，可以建立单一的损伤模型，没有人与人之间脊髓损伤易变的复杂性，并可以通过设置假手术组，来检测脊髓损伤和假损伤动物之间的代谢差异，避免了全身性反应(如全身炎症反应)对结果的影响，用以确定特异于脊髓损伤的生物标志物，这在临床研究中不可能做到。而且在动物模型中，可以按照时间点，纵向分析比较急性、亚急性和慢性脊髓损伤后不同时间点的代谢变化，动态观察脊髓损伤从损伤到自我修复整个过程中的病理生理机制。最后通过与人类样品相比较，来验证在动物模型身上发生的变化是否同样适用于人类。不管是人类还是动物模型都是为了鉴定脊髓损伤发展过程中具有潜在价值的生物标志物[18]。

Fujieda等[42]通过建立大鼠脊髓损伤模型，对脊髓损伤组和假手术组大鼠的脊髓组织进行非靶向色谱联用质谱的代谢组学分析对比，发现N-乙酰-天冬氨酸-谷氨酸(N-acetyl aspartic acid-glutamic acid,NAAG)和N-乙酰天门冬氨酸(N-Acetylaspartate,NAA)的水平显著降低，可能反映神经细胞死亡。而且NAA可以在人体内无创地测量，并有助于确定损伤严重程度并预测脊髓损伤后神经功能恢复的情况。Fujieda等[42]的研究提示NAA作为脊髓损伤相关特异性生物标志物的价值。Peng等[43]利用氢核磁共振(hydrogen nuclear magnetic resonance,1H-NMR)技术对脊髓损伤大鼠的血浆进行代谢组学分析，得到与Fujieda等[42]的研究类似的结果。但这些结果尚不能应用于临床的病情程度评估和预后判断，尚需要对人类标本进行代谢组学分析对比，来验证其可靠性。由于临床上获取人类脊髓标本是不可能的，而血浆受全身因素的影响较大，所以，脑脊液是进行临床研究的最佳选择。脑脊液是唯一与脊髓直接接触的体液，其成分的变化可直接显示中枢神经系统的代谢情况，如炎症、感染等，如果能够获取临床的脑脊液标本进行代谢组学研究，其结果将更加可靠。

4 总结

代谢组学作为基因组学和蛋白质组学的重要补充，已经渗透到科学研究的方方面面，具有良好的发展前景。虽然有研究通过不同方法已经找到脊髓损伤相关的特异性生物标志物，但是，相关研究较少，不能保证结果的可靠性。而且大多数研究结果都是通过动物实验获得，是否能与人类脊髓损伤后的变化相匹配，仍需要大量的临床实验来验证。所以，将这些结果应用于临床还有很大的困难，有待更多的高质量研究来证实。此外，任何单一“组学”或检测方法都不可能完全揭示疾病的发生发展过程，代谢组学研究的是机体物质代谢过程的终点，需要和其他“组学”或检测方法联合起来，进一步阐明疾病的病理生理过程，为患者得到最佳的治疗及康复提供可参考的依据。代谢组学作为“组学”大家庭的新成员，其本身并不完善，仍需在今后的不断实践中探索更加优化的样品处理及检测分析方法，进一步提高结果的准确性。相信随着代谢组学各项技术的不断更新完善，脊髓损伤甚至更多严重复杂疾病的病理生理机制将会得到进一步的揭示，将会为疾病的诊断及治疗打开一扇新的大门，更好地为人类谋福祉。