外泌体检测在骨肿瘤诊疗中的意义*

综述 审校

随着对恶性肿瘤认识的不断深入，临床医生逐渐发现恶性肿瘤诊断时组织活检存在弊端，包括组织活检时的有创性，在患者预后监测时无法重复取材等问题，使患者无法获得可持续性的精准医疗。而目前大家所关注和热衷的液体活检，则克服了组织活检的缺点，为恶性肿瘤的诊断和预后监测提供了新的思路。液体活检包括循环肿瘤细胞检测循环肿瘤DNA检测和外泌体检测。而肿瘤源性外泌体作为肿瘤”母体”细胞分泌的囊泡样结构，其内所包含的蛋白质、DNA、RNA等信息，在恶性肿瘤的转移、复发和化疗耐药等方面发挥着重要作用［1-6］。本文将外泌体的特性、生物学作用及在恶性肿瘤包括上皮来源和间叶组织来源恶性肿瘤发生发展中的作用和应用前景进行相关综述，为肿瘤源性外泌体在骨肉瘤和尤文肉瘤中的应用提供参考和思路。

1 外泌体结构特点和提取纯化

胞外囊泡是一种小体积的膜状囊泡，按照产生机制和直径的不同，可以分为三类：微囊泡（microparticles/microvesicles）、外泌体（exosomes）和凋亡小体（apoptotic bodies）。外泌体为多形性的囊泡样小体，可由各类细胞分泌，发源于细胞内吞系统中的晚期内体（late endosome或多囊泡内体）；直径30～100 nm；由双层磷脂分子包裹，形态呈扁形或球形小体，有些为杯状；其在体液中的存在形式以球形结构为主，通常可在蔗糖密度梯度溶液中密度1.13～1.19 g/mL获得富集。外泌体膜表面有一些蛋白，囊泡内部包含蛋白、RNA及细胞因子等物质。细胞通过胞膜内吞作用，首先形成早期胞内体（early endosome），在胞内进一步成熟形成晚期胞内体（late endosome）和多泡体（multivesicular bodies），通过出芽（budding）作用形成外泌体。外泌体的提取和纯化的方法主要包括差速离心联合蔗糖密度梯度离心法、超滤密度梯度离心、免疫磁珠提取法和ExoQuick Precipitation提取法，主要依据外泌体理化特性进行分离和提纯。

2 肿瘤源性外泌体在肿瘤发生发展过程中的作用

外泌体同靶细胞相互作用的机制包括：1）通过外泌体表面携带的功能性蛋白分子与靶细胞相互作用，并启动功能性信号传导过程；2）外泌体同靶细胞膜相互融合，将其所运输的功能性分子“注入”靶细胞内；3）靶细胞表面的蛋白受体在同外泌体接触后，可启动其内吞作用，将外泌体所携带的生物信息整合入靶细胞基因表达、转录和翻译的各个层面［7-19］。

肿瘤细胞逃避机体免疫捕获的过程中，其免疫抑制机制发挥着重要作用。肿瘤细胞可通过多种免疫抑制分子来削弱机体的免疫识别和应答过程。有研究［11］显示肿瘤性外泌体富含多种免疫抑制分子，其中包括FasL、IL-10、TGF-β1和PGE2等细胞分子。从该角度而言，外泌体可看作是肿瘤细胞侵袭和远处播散转移的重要帮凶。

对于肿瘤细胞外泌体在肿瘤的进展过程中发挥怎样的作用，其如何扮演肿瘤细胞帮凶的角色主要受肿瘤微环境调控机制和所携带的蛋白分子的影响。肿瘤转移机制的探究是肿瘤学研究的重要目标之一。早年英国医生Stephen Paget阐述的肿瘤转移的“种子与土壤理论”，主张转移需要肿瘤细胞的传播即“种子”和受纳器官的理想环境即“肥沃土壤”。而“种子与土壤理论”中的“种子”很可能就是肿瘤细胞产生的外泌体。该研究报道，外泌体膜表达整合素α6β1和α6β4的乳腺癌细胞外泌体可导致肿瘤细胞靶向性转移到肺部，而表达αvβ5的外泌体会导致其转移到肝脏，分别为乳腺癌肿瘤细胞转移前提供适宜的微环境，从而有利于肿瘤细胞的后续转移和增殖。目前大量研究证明，肿瘤细胞可以释放外泌体，为其侵袭和远处转移发挥作用。作为体液活检新兴的检测对象，其可在血浆、血清、尿液、腹水等体液中检测其存在，并有多项研究证明其在体液中的存在水平同肿瘤的侵袭、复发和转移密切相关。Melo等［20］报道基于外泌体标志物所建立的非侵入性的胰腺癌的诊断方法，此方法主要依靠检测锚定在血液中外泌体质膜上的磷脂酰肌醇聚糖-1（glypican-1，GPC1）来实现诊断效果。

有研究证实，吉非替尼联合化疗治疗对进展期非小细胞肺癌总体生存率改善不明显。Li等［21］研究结果显示，从吉非替尼干预后的非小细胞肺癌PC9细胞系提取的外泌体可以产生抵抗吉非替尼的抗肿瘤活性，而从化疗药物干预后的PC9细胞系提取的外泌体并无此特性，其说明经吉非替尼干预后的非小细胞肺癌产生的外泌体，可以通过上调肿瘤细胞的自噬来改变其对顺铂的敏感性。同时大量研究证实，非小细胞肺癌患者血清或血浆中外泌体水平和其所包含的蛋白组、micro-RNA组表达特点可以用于患者的诊断和预后判断。Kharmate等［22］通过扫描电镜和外泌体特异性标志物等手段对前列腺癌患者血清、细胞系上清液进行检测后发现，上述材料中均可以检测到前列腺癌细胞分泌的外泌体的存在；并且外泌体中同肿瘤转移密切相关的表皮生长因子受体（EGFR）水平明显升高，证明前列腺癌细胞分泌的外泌体同其远处转移的发生密切相关。Zhang等［7］比较了204例接受硼替佐米治疗的多发性骨髓瘤患者后发现，患者血清中外泌体microRNA表达的差异同硼替佐米治疗敏感性相关。当外泌体中miR-16-5p、miR-15a-5p、miR-20a-5p、miR-17-5p表达下调时，多发性骨髓瘤患者易对硼替佐米产生耐药性。由此可见，体液中存在的肿瘤细胞外泌体因携带其“母体”肿瘤细胞的部分功能性蛋白及基因，并作为肿瘤“液态活检”的一种新途径，受到肿瘤研究者的广泛关注。肿瘤源性外泌体对原发部位肿瘤微环境的影响主要包括：肿瘤源性外泌体可以稳定肿瘤细胞表面突出小泡（cellular protrusions），其可通过沉积间质来源的纤维连接蛋白等物质促进肿瘤细胞的持续迁移；外泌体释放的基质金属蛋白酶可直接参与肿瘤微环境中的胞外基质重塑，有助于肿瘤细胞在组织中迁移；肿瘤源性外泌体可以促进前体肿瘤支持细胞分化成熟，肿瘤细胞和成纤维细胞来源的外泌体相互作用，可增加肿瘤细胞耐药性。对转移部位的微环境调控主要包括：肿瘤源性外泌体可增加细胞通透性，促进肿瘤细胞通过循环系统向远处转移，同时可以促进转移部位胞外基质重塑及骨髓来源细胞的再动员。

3 外泌体检测在骨肿瘤中的研究进展

对于间叶组织来源的骨肉瘤而言，由于肿瘤异质性明显同时又缺乏经典的肿瘤标志物，因此以细胞经典标志物为手段的循环肿瘤细胞检测在间叶组织来源恶性肿瘤例如骨肉瘤和尤文肉瘤等的预后监测中的作用受到显著制约。

骨肉瘤源性外泌体中含有丰富的可溶性蛋白、RNA和microRNA等，同骨肉瘤的侵袭、转移及血管生成等功能密切相关。Jerez等［23］对骨肉瘤细胞系MG63、SAOS-2和U2OS进行蛋白组学分析，结果显示上述细胞系分泌的外泌体中含有丰富的同骨肉瘤血管生成、细胞黏附和细胞迁移相关的蛋白成分，从而进一步证实骨肉瘤细胞源性外泌体同其他上皮来源恶性肿瘤分泌的外泌体作用相似，均对其“母体”细胞的侵袭和远处转移有重要的协助作用。同时有研究［24］显示，143B细胞系细胞悬液中外泌体含量明显高于侵袭性相对较弱的HOS细胞系，并且143B细胞系来源的外泌体中包含有丰富的破骨相关的蛋白表达，如MMP-1、MMP-13、RANKL、TGF-β、CD-9。RANKL（receptor activator for nuclear factor-λB ligand，核因子λB受体活化因子配体）的表达在骨转移癌和骨巨细胞瘤中的表达具有重要的意义，RANKL特异性的单克隆抗体迪诺单抗直接同成骨细胞表面的RANKL结合，从而抑制RANKL和破骨前体细胞表面的RANK结合，从而抑制破骨前体细胞的形成和活化，进而抑制骨转移癌和骨巨细胞瘤的溶骨过程。同时Branstetter等［25］报道显示，56例骨肉瘤样本中RANKL阳性表达率为68%，其中很大一部分表达强度较低，仅16例样本为明显表达。也有报道［26］骨肉瘤样本RANKL阳性表达率仅9%。由此可见，骨肉瘤细胞RANKL表达情况十分不稳定，因此骨肉瘤细胞系来源的外泌体中RANKL的表达究竟有何意义，如何利用此特性来抑制骨肉瘤的进展，仍是值得我们研究和思考的问题。骨肉瘤源性外泌体可以通过降低CD4+和CD8+T细胞增殖、细胞活性和促进免疫抑制相关细胞因子TGF-β、αfetoprotein、热休克蛋白的表达来影响机体免疫功能，从而实现骨肉瘤细胞的免疫逃逸［27］。同恶性肿瘤标本相比，肿瘤源性外泌体较易从体液（包括血清、血浆和尿液）中获得，因此其可能在骨肉瘤的诊断及预后研究中具有重要的意义［28］。有研究［29］显示，血清中miR-25-3p水平可以作为骨肉瘤患者预后较为有价值的诊断指标，同术后患者是否发生远处转移存在明显的相关性。该研究中比较了14例骨肉瘤、14例非骨肉瘤和8例健康志愿者血清中miR-25-3p的水平，骨肉瘤患者miR-25-3p水平明显高于后两者。同时在骨肉瘤细胞系SaOS2、HOS、U2OS和143B的细胞悬液中分离提取得到的骨肉瘤源性外泌体中，同样检测到较高水平的miR-25-3p的表达。虽然该研究中标本是来源于患者血清并非直接来源于患者血清中的外泌体，但其研究者认为循环血液中的microRNA是主要存在磷脂膜样结构中，其中包括外泌体、胞外囊泡和凋亡小体中。尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase plasminogen activator，uPA）在转移型骨肉瘤细胞系（KHOS，KRIB，143B）表达水平明显高于非转移型骨肉瘤细胞系（HOS，MG63，G292），同时KHOS细胞系胞质中uPA水平明显低于细胞悬液中KHOS细胞系源性外泌体中表达的水平，说明骨肉瘤肺转移表型的转化同尿激酶型纤溶酶原激活物/尿激酶型纤溶酶原激活物受体有关，并且在骨肉瘤表型转化和骨肉瘤肺转移过程中，其可能通过外泌体介导的旁分泌和自分泌方式发挥作用［30］。

外泌体除了在骨肉瘤中发挥着重要作用以外，在尤文肉瘤的发生发展中也可能有着重要作用。Miller等［31］首次在Ewing肉瘤细胞系中证明外泌体的存在，并且外泌体中同时检测到Ewing肉瘤较为特异的融合基因EWS-FLI1的表达。

4 外泌体研究的应用前景

外泌体膜表面所携带的蛋白分子来源于肿瘤细胞膜表面，因此不同肿瘤细胞所释放的外泌体往往携带不同的表面蛋白，将肿瘤患者体液中的外泌体进行分离后，利用基因组学和蛋白质组学等高通量检测手段，明确体液中肿瘤性外泌体和正常人群之间的差异表达及特征性蛋白，对于疾病的诊断及预后的评估具有良好的临床价值和意义。与此同时，可以根据蛋白质组学筛选的外泌体表面特异性蛋白，对分离得到的外泌体进行鉴定，也可利用此原理来鉴别正常细胞还是肿瘤细胞产生的外泌体。由于外泌体具备向定向靶器官转移的特性，可设计其作为药物精准给药的载体，将所装载的药物运输到靶器官发挥作用，其在药物靶向载体的应用研究中也颇具潜力。Shimbo等［32］报道通过外泌体向骨肉瘤细胞转染miR-143虽然转染效率不及质粒，但对于骨肉瘤转移能力的抑制作用相似，原因可能是虽然外泌体的转染效率低，但已足以抑制骨肉瘤的转移能力。

外泌体检测作为体液活检的重要部分，已得到广大学者的重视。其不但在上皮来源恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用，而且对于异质性更强的间叶组织来源的恶性肿瘤尤其是骨肉瘤和尤文肉瘤的诊断、预后监测和治疗可能同样有着重要作用和意义，因此对于恶性骨肿瘤疾病的外泌体研究同样需要引起广大学者的关注。

（2018-03-12收稿）

（2018-05-04修回）