高效阴离子交换色谱—脉冲安培检测法用于重组人促红素中唾液酸的含量测定

李响 于雷 范文红

[摘要] 目的 建立高效陰离子交换色谱-脉冲安培检测法（HPAEC-PAD）测定重组人促红素（rhEPO）中唾液酸含量的方法。 方法 将rhEPO样品用5 mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）换液后，调整浓度到0.33 mg/mL，取20 μL样品溶液加入10 mU/μL的神经氨酸酶20 μL，37℃孵育1 h后，加入0.04 mmol/L的尤罗索尼克酸（KDN）内标物50 μL，再加入70 μL超纯水，混匀后分析测定。采用CarboPac PA1分析柱，CarboPac PA100保护柱，流动相为150 mmol/L氢氧化钠与125 mmol/L乙酸钠混合溶液，柱温30℃，流速1.0 mL/min，等度洗脱，数据采集时间15 min。根据唾液酸峰面积与KDN内标峰面积的比值与含量的量效关系，计算样品中的唾液酸含量。 结果 唾液酸标准品浓度在0.0015～0.0075 μg/mL范围内与唾液酸峰面积与KDN内标峰面积的比值呈良好的线性关系，R2 > 0.99；重复性RSD < 4%；（低、中、高浓度）样品回收率分别为94.9%、94.3%、96.7%。用建立的HPAEC-PAD法测定了6批rhEPO中唾液酸含量，与间苯二酚测定法测定结果比较差异无统计学意义（P = 0.7488）。 结论 本研究建立了rhEPO中唾液酸含量测定的HPAEC-PAD方法，该方法线性、重复性、稳定性良好，适用于rhEPO的唾液酸含量的常规测定。

[关键词] 高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法；重组人促红素；唾液酸；含量

[中图分类号] R917 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）09（c）-0102-04

[Abstract] Objective To develop a high-performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection （HPAEC-PAD） method to determine the content of sialic acid in recombinant human erythropoietin （rhEPO）. Methods The rhEPO samples were prepared by changing rhEPO bulks to 5 mmol/L phosphate buffer （pH 7.0）， and adjusted to 0.33 mg/mL. Taking 20 μL sample solution， and then 20 μL of 10 mU/μL neuraminidase was added， followed by incubation at 37℃ for 1 h. Finally， 50 μL 0.04 mmol/L ketodeoxynonulosonic acid （KDN） and 70 μL milli-Q water were added and mixed thoroughly followed by detection. CarboPac PA1 separation column and CarboPac PA100 guard column were used， with mobile phase being mixture of 150 mmol/L sodium hydroxide solution and 125 mmol/L sodium acetate solution， column temperature being 30℃， flow rate being 1.0 mL/min， and the data acquisition time being 15 min with isocratic elution. The sialic acid content was calculated based on the dose-effect relation of the ratio of peak area of sialic acid to KDN and the content of sialic acid. Results The concentrations of sialic acid standard solutions and the ratios of peak area of sialic acid to KDN showed a good linearity relationship between 0.0015 and 0.0075 μg/mL with R2 being higher than 0.99， the repeatability RSD was below 4%. The recovery rates of samples at low， medium and high concentration were 94.9%， 94.3% and 96.7%， respectively. Six batches of rhEPO were tested by the developed HPAEC-PAD method and the results had no significant differences compared with the results of resorcinol method （P = 0.7488）. Conclusion This research has successfully established the HPAEC-PAD method to determine the content of sialic acid in rhEPO， with good linearity， repeatability and robustness， which can be used in routine determination of sialic acid in rhEPO.

[Key words] High-performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection； Recombinant human erythropoietin； Sialic acid； Content

重组人促红素（recombinant human erythropoietin，rhEPO）是利用基因重组技术将人的EPO基因转入哺乳动物细胞内高效表达的一种高度糖基化的蛋白质，具有促进红细胞生成的作用，主要用于治疗慢性肾功能衰竭产生的贫血[1-3]。rhEPO有165个氨基酸，3个N糖和1个O糖位点[4]，糖链含量可达40%。高度且不均一的糖基化会影响促红素体内活性[5-7]，这种不均一很大程度上是由糖链末端的N-乙酰神经氨酸，即唾液酸化引起的，唾液酸化程度的高低直接影响着促红素蛋白的体内半衰期，与rhEPO的生物学体内活性息息相关，是重要的质控指标[8-9]。

《中国药典》2015年版三部对促红素唾液酸含量的测定采用间苯二酚法[9-12]，所用有机化学试剂较多，操作步骤繁琐，目前已有研究建立液相色谱用于测定唾液酸含量[13-17]。由于唾液酸无紫外吸收峰，液相色谱多采用荧光试剂衍生化的方法进行间接测定。本研究采用脉冲积分安培检测器，通过检测工作电极表面发生氧化或还原反应时产生的电流变化，建立了高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法（high-performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD），该方法不需要对唾液酸进行衍生化处理，可直接分离测定rhEPO的唾液酸含量[18-19]。

1 仪器与试剂

主要仪器：离子色谱系统（thermo，ICS-5000+SP）；积分安培检测器（thermo）；UV分光光度计（beckman，R-500）；离心机（eppendorf，centrifuge5424，离心半径5 cm）；色谱柱（thermo，CarboPac PA-100 guard column，CarboPac PA-1，CarboPac PA-100）；10 kD超滤离心管（millipore）。

主要试剂：N-乙酰神经氨酸（sigma，SLBM6684V）；尤罗索尼克酸（ketodeoxynonulosonic acid，KDN）（Worthington，5-SYQ-138-1）；神经氨酸酶（newengland，0151408）；50%氢氧化钠溶液（thermo，MKCC0616）；乙酸钠（sigma，043K0111）；磷酸氢二钠（国产分析纯，20160219）；磷酸一氢钠（国产分析纯，20170810）。

2 方法与结果

2.1 rhEPO样品的处理

取rhEPO样品200 μL至10 kD超滤离心管中，加入5 mmol/L的磷酸盐（pH 7.2）缓冲液200 μL，13 000 r/min，离心10 min，重复3次，调整浓度到0.33 mg/mL，此为酶切用样品。取酶切用样品20 μL，加入10 mU/μL的神经氨酸酶20 μL，混匀后，于37℃孵育1 h后，加入0.04 mmol/L的KDN内标物50 μL，再加入超纯水70 μL，混匀后备用，此为供试样。

2.2 空白对照的制备

取5 mmol/L的磷酸盐缓冲液20 μL，加入10 mU/μL的神经氨酸酶20 μL，混匀后，如“2.1”方法处理备用，此为空白对照品。

2.3 唾液酸标准溶液的配制

精密称取24 mg唾液酸，用超纯水定容到5 mL，取适量该溶液用超纯水稀释4倍得到唾液酸标准品母液，浓度为1.2 mg/mL，将唾液酸标准品母液稀释到12 μg/mL，此为标准品工作液，依次取标准品工作液20、40、60、80、100 μL，分别加入浓度为0.04 mmol/L的KDN内标物50 μL，再分别依次加入90、70、50、30、10 μL的超纯水，混匀备用，此为唾液酸标准品溶液。含量依次为0.0015、0.003、0.0045、0.006、0.0075 μg/μL。

2.4 唾液酸内控品的制备

取标准品工作液50 μL，加入0.04 mmol/L的KDN内标物50 μL，再加入60 μL的超纯水，混匀备用，此为唾液酸内控品，含量0.003 75 μg/μL。

2.5 HPAEC-PAD法

HPAEC-PAD法流動相为150 mmol/L氢氧化钠与125 mmol/L乙酸钠混合溶液。电位参数设置：0～0.20 s，+0.10 V；0.20～0.40 s，+0.10 V；0.41～0.42 s，-2.00 V；0.43 s，+0.60 V；0.44～0.50 s，-0.10 V，积分安培信号采集区间为0.20～0.40 s。进样量20 μL，柱温30℃，流速1.0 mL/min，等度洗脱，数据采集时间15 min。根据唾液酸标准品峰面积与KDN内标峰面积的比值与含量的量效关系，计算样品中的唾液酸含量。

2.6 间苯二酚法

参照《中国药典》2015版三部附录3102[12]进行。

2.7 线性关系考察

唾液酸标准溶液的色谱图见图1。以唾液酸峰面积与内标KDN峰面积比为纵坐标，唾液酸含量为横坐标绘制标准曲线，方程为y = 119.73x + 0.0137，R2 = 0.9987。标准品含量梯度在范围0.0015～0.0075 μg/μL内，线性良好。

2.8 重复性与稳定性

取1批rhEPO样品相隔12 h测定2次，每次重复进样5次，测定结果汇总见表1。每次试验测得的唾液酸含量RSD值均<5%，且2次测定结果间差异无统计学意义（P = 0.3013）。表明该方法精密度高，重复性好，12 h内稳定。

2.9 回收率考察

取1批rhEPO样品按“2.1”条件处理后，与唾液酸内控品按照8∶2（低）、5∶5（中）、2∶8（高）的体积比混合进样分析，重复进样3次，考察回收率情况，回收率均值在94%～97%之间，表明该方法准确度良好。见表2。

2.10 rhEPO原液唾液酸含量的测定

取6批rhEPO原液，按“2.1”条件处理样品，采用建立的HPAEC-PAD法测定唾液酸含量，同时采用间苯二酚法测定，离子色谱实验图谱见图2，实验结果见表3，两种方法测定结果差异无统计学意义（P = 0.7488）。

3 讨论

本研究采用阴离子交换色谱，测定了6家不同企业生产的rhEPO原液的唾液酸含量，流动相选择氢氧化钠和醋酸钠的水溶液。其中氢氧化钠提供洗脱离子OH-，而且流动性的碱性pH条件也是唾液酸在金电极表面进行氧化反应，实现脉冲积分安培检测的必要条件。

脉冲积分安培检测器对糖类分析测定时，多选择用金电极[20]，本研究采用金工作电极、Ag/AgCl参比电极。在pH 12～13溶液中，在金工作电极和Ag/AgCl参比电极之间施加一个较高的电位，唾液酸在金电极表面被氧化，而如果电位过高时，金电极本身形成表面氧化层，会导致检测响应值逐渐降低。电位的设置主要分为短的延迟区（E1），用于减小基线漂移，电流积分区（E2），为唾液酸和电极表面被氧化的正电位，一般应不低于0.05 V。受金电极氧化的限制，E2不宜太高，否则背景和噪音将增加，本实验选择0.1 V。在积分完毕后，将电位降至清洗电位区（E3）（-2 V），对电极进行还原，阻止金电极被过度氧化，然后迅速升高电位至活化电位区（E4）（+0.6 V），再立即回到初始电位E1，整个积分周期为0.5 s。经过对检测唾液酸的施加电位的优化，克服了基线漂移，降低了背景噪音。

本研究建立了rhEPO的唾液酸含量测定的离子色谱方法，方法线性，重复性，稳定性良好，可用于rhEPO的唾液酸含量分析测定。

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（收稿日期：2018-04-02 本文编辑：张瑜杰）