黄芩苷通过抗氧化对H2O2诱导的SH—SY5Y细胞损伤的保护作用

吴宜艳 韩杨 李玲玉

[摘要] 目的 探讨黄芩苷通过抗氧化对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。 方法 将SH-SY5Y细胞按照培养方法的不同分成五组：对照组（正常培养基），模型组（200 μmol/L H2O2），低、中、高剂量黄芩苷组（先用50、100、200 μmol/L药物保护，然后用H2O2损伤）。采用MTT法检测SH-SY5Y细胞的存活率，Western blot法检测细胞的硫氧还蛋白（Trx）表达，采用试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、脂质氧化丙二醛（MDA）的含量。 结果 模型组吸光度与细胞存活率显著低于对照组（P < 0.01），与模型组比较，不同剂量黄芩苷组吸光度与细胞存活率均不同程度升高，其中，低、中剂量黄芩苷组与模型组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与对照组比较，模型组MDA升高，Trx、SOD和GSH-Px降低（P < 0.01）。与模型组比较，低、中剂量黄芩苷组MDA降低，Trx、SOD及GSH-Px升高，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 黄芩苷对H2O2诱导损伤的SH-SY5Y细胞具有保护作用，其作用机制可能与抗氧化作用有关。

[关键词] 黄芩苷；抗氧化作用；神经损伤；保护作用

[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）09（c）-0008-04

[Abstract] Objective To investigate the protective effects of baicalin on damaged SH-SY5Y cells induced by H2O2 through antioxygenation. Methods According to the different culture methods， SH-SY5Y cells were divided into five groups： control group （normal culture media）， model group （200 μmol/L H2O2）， low， medium， high dose of baicalin groups （protected by 50， 100， 200 μmol/L baicalin first， then damaged by H2O2）. The survival rate of the SH-SY5Y cells were determined by MTT. The expression of thioredoxin protein （Trx） in cells was detected by Western blot. The contents of superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px） and lipid oxidative malonaldehyde （MDA） were detected by kits. Results The absorbancy and cell survival rate in the model group were significantly lower than those of control group （P < 0.01）. Compared with model group， the absorbancy and cell survival rate of different doses of baicalin groups were all increased to different degrees， among which， there were highly statistically significant differences of low， medium doses of baicalin groups cpmpared with model group （P < 0.01）. Compared with control group， the MDA of model group increased significantly， while the Trx， SOD and GSH-Px decreased significantly （P < 0.01）. Compared with model group， the MDA of low， medium doses of baicalin groups decreased， while the Trx， SOD and GSH-Px increased， there were statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Baicalin has protective effects on the damaged SH-SY5Y cells induced by H2O2， the mechanism may be related to antioxidation.

[Key words] Baicalin； Antioxygenation； Nerve injury； Protective effect

氧化應激是引起神经损伤的原因之一，氧化代谢产物丙二醛（MDA）等合成的增加，会进一步加重神经元功能的损伤[1-2]。SH-SY5Y细胞源自人成神经母细胞瘤SK-N-SH系，此细胞能够表达神经元所特有的酪氨酸羟化酶、多巴胺、多巴胺-β羟化酶和多巴胺转运体[3]，因此它常作为多巴胺能细胞模型，用于神经系统疾病的发病及作用机制方面的研究[4-7]。H2O2是重要的活性氧之一，在活性氧的作用下，组织细胞会因脂质过氧化，产生许多脂自由基活性氧，使类脂中的不饱和脂肪酸发生过氧化反应，破坏细胞膜的结构，导致组织细胞受损。研究表明黄芩苷能通过血脑屏障进入大脑等中枢神经系统[8]并且能保护神经元，降低神经功能损伤[9]，但是黄芩苷保护神经损伤的机制不明。本研究建立了H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤模型，检测黄芩苷对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤后硫氧还蛋白（Trx）的表达，超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）及MDA的含量变化的影响，以研究黄芩苷对神经元保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

IX70-142倒置式生物显微镜（日本奥林巴斯）；MCO-17AIC二氧化碳培养箱（日本三洋）；MDL550酶标定量测定仪（美国伯乐公司BIO-RAD）。黄芩苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110715-200212）；SH-SY5Y细胞株（上海锐聪实验设备有限公司）；人Trx抗体（兔多克隆抗体，Abcam公司，货号：ab26320）；DMEM/F12培养基和胎牛血清（Hyclone公司，货号：SH30023.01B和SH30084）；青霉素和链霉素（Gibco公司，货号：15140-122）；苯甲基磺酰氟（PMSF，Sigma公司，货号：p-7626）；SOD、GSH-Px、MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20141211）。

1.2 SH-SY5Y细胞培养及分组

细胞贴壁生长于含有10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM/F12培养基中，放置于含有5%CO2的37℃培养箱中培养，每2～3天换液1次，每6～7天传代1次，选取对数生长期的SH-SY5Y细胞进行实验，分成五组：对照组，模型组，低、中、高剂量黄芩苷组。

1.3 药物配制

黄芩苷贮备液：将黄芩苷对照品用无菌二甲基亚砜（DMSO）溶解并配制成10 mmoL/L的溶液；30%H2O2贮备液：将H2O2用灭菌三蒸水配制成10 mmoL/L的溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后4℃冰箱保存备用。上述两种贮备液临用时均以DMEM/F12培养基稀释至所需浓度。单去污剂：1 mol/L Tris·HCl（pH 8.0）2.5 mL，NaCl 0.438 g，曲拉通X-100 0.5 mL，加去离子水至50 mL，4℃保存备用。临用前取2.87 mL PMSF加入50 mL单去污剂中混匀即可用于细胞裂解提取蛋白。

1.4 MTT法检测黄芩苷对H2O2诱导损伤的SH-SY5Y细胞存活率的影响

将对数生长期的SH-SY5Y细胞以1×104个的密度接种至96孔板中，空白孔和对照组用正常培养基培养，模型组用含有200 μmol/L H2O2的培养基培养，低、中、高剂量黄芩苷组分别加入终浓度为50、100、200 μmol/L的黄芩苷预培养24 h，再加入终浓度为200 μmol/L的H2O2继续作用24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液30 μL，继续孵育4 h，吸弃上清液，每孔加入DMSO 200 μL，充分震荡10 min后，用酶标仪在450 nm波长处测定OD值。细胞存活率=（实验组OD-空白组OD）/（对照组OD-空白组OD），以观察黄芩苷对H2O2诱导损伤的SH-SY5Y保护情况。

1.5 Western blot法检测黄芩苷对H2O2诱导损伤的SH-SY5Y细胞Trx蛋白表达的影响

取对数生长期SH-SY5Y细胞，以2×105个的密度接种至6孔板中，于单层细胞贴壁并融合至约80%时进行实验。低、中、高剂量黄芩苷组预先加入上述不同浓度的黄芩苷溶液作用24 h后，除对照组外，其余各组均加入H2O2并使其终浓度为200 μmol/L，再作用24 h后，于各组6孔板内加入500 μL裂解液（含PMSF），用研磨棒在冰上充分研磨组织，然后冰浴10 min，旋涡混合仪上震动30 s，并在离心半径为10 cm的离心机上，4℃ 12 000 r/min离心15 min，提取总蛋白。SDS-PAGE凝胶使用10%丙烯酰胺分离胶和5%丙烯酰胺浓缩胶。取样品100 ng点样，电泳，转膜，用BSA封闭1 h。用BSA配制的Trx抗体4℃过夜孵育。第2天用PBST洗3遍，每次10 min，然后用TBS配制的二抗Goat Anti-Rabbit IgG室温孵育1.5 h，TBS洗3遍，每次10 min，DAB显影，拍照。

1.6 分光光度法检测各组细胞MDA、SOD和GSH-P指标

低、中、高剂量黄芩苷组预先加入上述不同浓度的黄芩苷溶液作用24 h后，除对照组外，其余各组均加入H2O2并使其终浓度为200 μmol/L，再作用24 h后，于各组6孔板内加入500 μL裂解液（含PMSF），用研磨棒在冰上充分研磨组织，然后冰浴10 min，加入适量冷裂解液，研磨匀浆，并在离心半径为10 cm的离心机上，以3000 r/min离心10 min后取上清液，按试剂盒说明书，通过紫外分光光度计测定各组细胞MDA、SOD和GSH-P含量。

1.7 统计学方法

采用Graph Pad Prism 5.0软件处理数據。计量资料以均数±标准差（x±s）表示。多组比较采用One Way ANOVA检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同剂量黄芩苷对H2O2诱导损伤的SH-SY5Y细胞存活率的影响

模型组吸光度与细胞存活率显著低于对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01），与模型组比较，低、中、高剂量黄芩苷组细胞的吸光度与细胞存活率均不同程度升高，但高剂量黄芩苷组与模型组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），而低、中剂量黄芩苷组与模型组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

2.2 不同剂量黄芩苷对H2O2诱导损伤的SH-SY5Y细胞Trx表达的影响

与对照组比较，模型组Trx表达下调，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，不同剂量黄芩苷预处理SH-SY5Y细胞24 h后，Trx表达均不同程度升高，但是高剂量黄芩苷组与模型组比较差异无统计学意义（P > 0.05），而低、中剂量黄芩苷组与模型组比较，差异有统计学意义（P < 0.01、P < 0.05）。见图1。

2.3 不同劑量黄芩苷对H2O2诱导损伤的SH-SYSY细胞SOD、GSH-Px、MDA表达影响

与对照组比较，模型组MDA升高，SOD和GSH-Px降低，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；不同剂量黄芩苷预处理SH-SY5Y细胞24 h后，高剂量黄芩苷组MDA、SOD和GSH-Px与模型组比较差异均无统计学意义（P > 0.05），低、中剂量黄芩苷组与模型组比较，MDA降低，SOD、GSH-Px升高，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表2。

3 讨论

随着世界人口老龄化加剧，阿尔茨海默病（AD）发病率不断升高，神经损伤问题日趋严重。AD是一种退行性疾病，临床上主要表现为认知能力下降、渐进性记忆力减退，是最常见的一种老年痴呆。国内外学者一直在探讨其发病机制，但AD病因复杂，其发病机制尚不清楚[10]。

氧化应激在神经损伤等疾病的发生、发展中起促进作用，可用于其病情及预后的评估。MDA是常见的氧化应激标志物之一，MDA可在人体内自然形成，参与机体的脂质过氧化反应，对机体产生极大毒性损害。根据机体内MDA水平可判断生物体内脂质过氧化反应的情况，从而推测自由基对神经组织的损伤情况。SOD可反映机体对氧自由基的清除能力，是一种含有金属元素的活性蛋白酶，具有高度专一性，SOD活性水平降低与神经组织受损直接相关[11]。GSH-Px是谷胱甘肽系统中一种重要的酶，它能调节细胞氧化还原平衡，它在降低过氧化氢或氧化型脂质的水平中起到重要作用[12]。文献报道，神经损伤组织中MDA水平较高而SOD、GSH-Px明显降低[11-12]。

Trx是一种分子量12 kD的小分子蛋白质，具有氧化还原活性[13]，广泛存在于生物体组织中，也是脑内一种重要的抗氧化蛋白。研究表明，Trx参与机体的氧化还原反应，调节一些重要转录因子的活性和抑制细胞凋亡[14-16]。SH-SY5Y细胞常用于神经损伤方面的研究，H2O2作用于细胞使细胞中脂质过氧化，破坏细胞膜的结构，导致组织细胞受损，是常用的细胞损伤模型[17]。

研究表明黄芩苷能直接作用于中枢神经系统的神经元细胞，对神经系统有保护作用[18-21]。本研究建立了H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤模型，H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤后MDA明显增加，SOD、GSH-Px明显降低，这与文献报道相一致[11-12]。本研究结果提示低、中剂量黄芩苷能够逆转H2O2的损伤情况，增加SH-SY5Y细胞存活率，对SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用。同时提示，黄芩苷能够降低损伤细胞的MDA水平从而减少脂质过氧化反应，增加SOD和GSH-Px活性，说明中低剂量黄芩苷能增加损伤细胞的氧自由基清除能力及调节细胞的氧化还原平衡能力。中低剂量黄芩苷增加了Trx蛋白表达水平，进一步提示黄芩苷通过调节Trx来增强细胞调节氧化还原反应的能力。但是本研究结果发现高剂量黄芩苷组作用不明显，可能是因为黄芩苷浓度过高反而有细胞毒性，具体情况有待进一步研究。总之，适量的黄芩苷可以通过抗氧化对神经细胞起到保护作用。

黄芩苷具有很强的药理活性，其抗氧化作用既对各种因素引起的脑损伤神经元细胞有明显保护作用，又能通过多种信号转导通路对细胞凋亡进行调节。综上所述，黄芩苷是通过参与调节Trx蛋白的氧化还原系统和细胞凋亡途径，进而发挥对神经元细胞的保护作用，本研究结果与以往的报道一致[18-19]。

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（收稿日期：2017-11-30 本文编辑：张瑜杰）