羧甲基壳聚糖逆转骨肉瘤MG—63/ADM细胞耐药性的研究

丁万军 曾涛 郭卫春

[摘要] 目的 觀察羧甲基壳聚糖（CMC）逆转人骨肉瘤耐药细胞株MG-63/ADM的耐药作用并初步探讨其机制。方法 体外培养建立人骨肉瘤耐药MG-63/ADM细胞株，MTT检测其耐药性；用不同浓度（50、100、200 μmol/L）CMC+阿霉素2.0 μg/mL作用于骨肉瘤MG-63/ADM细胞24、48、72 h后，采用MTT法测各组细胞生长抑制率；采用Western blot方法检测不同浓度CMC处理后MG-63/ADM细胞P糖原蛋白（P-gp）及胞核中核转录因子-κB P65（NF-κB P65）的表达水平。 结果 MTT结果显示MG-63/ADM细胞株对阿霉素（ADM）明显耐药，IC50为（1.97±0.56）μg/mL，耐药指数为11.35；CMC联合ADM 2.0 μg/mL能明显抑制MG-63/ADM细胞的增殖，且其抑制作用与CMC呈时间和剂量依赖性（P < 0.01）。Western blot检测结果显示，MG-63/ADM细胞组较MG-63细胞组P-gp的表达水平明显升高（P < 0.05），且用不同浓度CMC处理的MG-63/ADM细胞组P-gp表达均明显低于MG-63/ADM细胞组（不加药物）（P < 0.05）；MG-63/ADM细胞组较MG-63细胞组NF-κB P65的表达水平明显升高（P < 0.05），且不同浓度CMC处理的MG-63/ADM细胞组胞核NF-κB P65表达明显低于MG-63/ADM细胞组（不加药物）（P < 0.05）。 结论 CMC可部分逆转MG-63/ADM细胞的耐药现象的作用，其机制可能与通过抑制NF-κB信号通路激活而抑制P-gp表达相关。

[关键词] 羧甲基壳聚糖；骨肉瘤；耐药；MG-63细胞株

[中图分类号] R738 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）09（c）-0004-05

[Abstract] Objective To observe the effect of reversing drug resistance of carboxymethyl chitosan （CMC） on human osteosarcoma resistant cell line MG-63/ADM and preliminary explore its mechanism. Methods Human osteosarcoma drug resistant MG-63/ADM cell line was cultured in vitro. The drug resistance was detected by MTT； after 24， 48 and 72 h of osteosarcoma MG-63 /ADM cells were treated with CMC + adriamycin 2.0 μg/mL， and the inhibition rate of cell proliferation in each group was measured by MTT method. The expression of P-gp in MG-63/ADM cells and the expression of NF-κB P65 protein in nucleus of MG-63/ADM cells after treated with the different concentrations of CMC were detected by Western blot. Results MTT results showed that MG-63/ADM cells were resistant to adriamycin， IC50 was （1.97±0.56） g/mL， the resistance index was 11.35； CMC could significantly inhibit MG-63/ADM cells proliferation， and the inhibitory effect was time and dose dependent （P < 0.01）. Western blot test results showed that the expression of P-gp in MG-63/ADM group was significantly higher than that in MG-63 group （P < 0.05）， and the expression of P-gp in MG-63/ADM treated with different concentrations of CMC was significantly lower than that in MG-63/ADM group （without drugs） （P < 0.05）. The expression level of NF-κB/P65 in MG-63/ADM group was significantly higher than that in MG-63 cell group （P < 0.05）. The expression of NF-κB P65 in the nucleus of CMC + ADM group was significantly lower than that of the control group （MG-63/ADM） （P < 0.05）. Conclusion Carboxymethyl can partly reverse the multidrug resistance in MG-63/ADM cells， and its mechanism may be related to the inhibition of NF-κB signaling pathway and the inhibition of P-gp expression.

[Key words] Carboxymethyl chitosan； Osteosarcoma； Drug resistance； MG-63 cell line

骨肉瘤是发病率最高的原发性骨恶性肿瘤，多见于10～20岁青少年，恶性程度高，易复发和转移，且预后差[1]。骨肉瘤好发于四肢骨，上肢多发生于肱骨近端，下肢多发生于胫骨近端以及股骨远端。骨肉瘤传统的治疗方法是截肢术[2]。20世纪80年代以来，逐步形成了新辅助化疗联合保肢手术及术后辅助化疗的新的骨肉瘤治疗策略，使患者5年生存率较之前提高近50%[3]。虽然保肢手术已经很成熟，然而仍有部分患者因肿瘤复发转移使得保肢治疗失败，导致治疗效果不佳。其主要原因之一是这部分患者对骨肉瘤的化疗药物产生了多药耐药（multidrug resistance，MDR）[4]。因此，进一步明确骨肉瘤耐药的机制并寻找能预防或逆转耐药的方法既是目前骨肉瘤治疗研究的热点之一，也是临床迫切需要解决的问题。甲壳素是自然界中存在的唯一带陽离子的天然多糖，广泛存在于虾、蟹等甲壳动物及各类昆虫的表皮；甲壳素脱乙酰化的产物称为壳聚糖[5]（chitosan，CTS）。羧甲基壳聚糖（carboxymethyl chitosan，CMC）为壳聚糖羧甲基基团修饰后的衍生物。有研究表明，CTS及CMC具有一定的抗肿瘤、抗炎、调节免疫等活性[6-7]。CMC是否对耐药细胞有逆转耐药作用，目前临床鲜有报道。本研究采用阿霉素（ADM）浓度递增培养法冲击诱导建立人骨肉瘤阿霉素耐药株（MG-63/ADM），观察CMC对体外培养的MG-63/ADM细胞对ADM的耐药逆转作用，并初步探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

人骨肉瘤MG-63细胞株（购自武汉大学典型培养物保藏中心）；RPMI 1640培养基（美国，Hyclone）；胎牛血清（FBS）（美国，Gibco）；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（碧云天生物科技有限公司）；青霉素、链霉素溶液（双抗）（美国，HyClone）；Trizol（美国，Invitrogen）；阿霉素（Doxorubicin，ADM）由Sigma公司提供；MTT试剂盒（武汉科昊佳生物科技有限公司）；羧甲基壳聚糖（武汉大学资环学院惠赠）；蛋白抽提-亚细胞结构胞浆和胞核蛋白提取试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），Western blot单克隆抗体均购自Santa Cruz公司；细胞培养瓶及96孔培养板由Coring公司生产，细胞培养箱（美国，Thermo）；Olympus IX70倒置荧光显微镜（日本，Olympus）；自动细胞计数器（美国，Thermo）；紫外凝胶成像系统（美国，Bio-Rad）；DYCz-24D型双垂直电泳槽（北京六一仪器厂）；JY-ECP3000型高压多用电泳仪（北京君意仪器有限公司）；UV-1000紫外透射分析仪（上海鄂禾仪器有限公司）；Lambda Bio 20型紫外-可见分光光度计（美国，PerkinElmer）。

1.2 观察指标及检测方法

1.2.1 MG-63细胞ADM耐药株的建立 按文献方法[8-9]，先用低浓度的ADM诱导作用MG-63细胞，然后ADM浓度逐步递增，通过间歇作用的方法诱导细胞耐药。首先，取对数生长期MG-63细胞接种至含ADM的DMEM培养液中，ADM从0.05 mg/L的低浓度开始，作用48 h后即弃去含ADM的培养液，重新加入不含ADM的培养液培养，使其恢复正常生长，待MG-63细胞生长至培养瓶底80%～90%时进行胰酶消化传代，随后用浓度为0.1 mg/L的ADM处理传代肿瘤细胞48 h。按以上方法，重复ADM处理、换液培养、传代的培养过程，在此过程中按照0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL逐步递增ADM药物浓度。将MG-63细胞在2 μg/mL的ADM中可以稳定生长时所获得的耐药细胞株命名为MG-63/ADM，整个耐药诱导历时70 d。整个试验过程中每4周重复检测1次该细胞的耐药性。

1.2.2 MG-63/ADM细胞的耐药性检测（MTT法） 将MG-63、MG-63/ADM用DMEM培养液，于培养箱中37℃，5%CO2条件下培养，待两种细胞均生长至培养瓶底80%～90%时行0.25%胰酶消化，然后800 r/min离心10 min，去除上清，分别收集两种细胞并接种于96孔板（1×104/孔），继续DMEM培养24 h后分组培养。处理组：加入含2 μg/mL浓度ADM的DMEM培养液；阴性对照组：加不含药物的培养基；空白调零组：无细胞，只加培养基，每组设6个复孔。将各组细胞继续培养，各组均取24、48、72 h时间点去除培养基行MTT检测。按MTT试剂盒方法，每孔加入100 μL的MTT溶液，继续培养4 h去除上清（不能移走结晶），每孔加入150 μL的二甲基亚砜，摇床低速震荡10 min待结晶溶解，全自动酶标仪测定OD值（490 nm吸光度）。细胞抑制率（inhibition rate，IR）计算公式：IR（%）=1-[（实验组OD值-调零组OD值）/（对照组OD值-调零组OD值）]×100%。

根据文献方法[10]，采用SPSS 18.0 probit analysis法计算ADM对MG-63、MG-63/ADM细胞的半数抑制浓度（half effective inhibition concentrations，IC50）；根据IC50的值计算耐药指数（resistance index，RI），RI=耐药组IC50/亲代细胞IC50。

1.2.3 MTT检测CMC对人MG-63/ADM细胞增殖活性的影响 培养MG-63/ADM细胞至培养瓶底80%～90%时（对数生长期），行0.25%胰酶消化，然后800 r/min离心10 min，去除上清，收集细胞并接种于96孔板（1×104/孔），细胞贴壁培养24 h后分组。ADM组：ADM 2.0 μg/mL；ADM+CMC组：不同浓度（50、100、200 μmol/L）的CMC+ADM 2.0 μg/mL；CMC组：不同浓度（50、100、200 μmol/L）的CMC，每组设6个复孔，每孔终体积为200 μL。各组细胞继续培养，取0、24、48、72 h时间点去除培养基行MTT检测。按MTT试剂盒方法，每孔加入100 μL的MTT溶液，继续培养4 h去除上清（不能移走结晶），每孔加入150 μL的DMSO，摇床低速震荡10 min溶解结晶，全自动酶标仪测定OD值（490 nm吸光度）。计算每组生长抑制率，实验重复3次。生长抑制率公式：细胞生长抑制率（%）=[1-（实验组OD值）/（对照组OD值）]×100%。

1.2.4 Western blot检测细胞膜P-gp及核转录因子-κB P65（NF-κB P65）的表达 实验分组：①MG-63组；②MG-63/ADM组；③MG-63/ADM+CMC组（CMC 50、100、200 μmol/L，48 h）。蛋白提取步骤：①PBS洗细胞3次；②加入裂解缓冲液（1.5×106个细胞大约加入100 μL裂解液），冰上放置20 min；③收集裂解液；④12 000 r/min离心2～10 min；⑤吸取上清，蛋白定量，分装，保存在-80℃备用。蛋白提取裂解液采用胞浆和胞核蛋白提取试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。蛋白浓度检测用BCA蛋白检测试剂盒按操作说明进行测定。电泳方法：①配制10%的SDS-PAGE胶；②将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加Loading buffer后直接上样，样品两侧的泳道用等体积的1×Loading buffer上样，Marker采用1×Loading buffer调整至与样品等体积；③用恒流30 mA电泳至目的蛋白泳动至距胶下缘1 cm以上结束（约1 h）；④转膜：采用湿转法，恒流100 mA过夜转膜，将P-gp及NF-κB p65蛋白转到PVDF膜。随后进行封闭剂杂交：将膜移至含有封闭液的平皿中，室溫下脱色摇床上摇动封闭1 h，而后加入单克隆小鼠抗P-gp抗体（1∶500）、多克隆兔抗NF-κB p65抗体（1∶400）和单克隆小鼠抗β-actin抗体（1∶1000），在37℃孵育1 h后转至4℃孵育过夜，以TBS-T洗涤3次，每次5 min，加入对应二抗：山羊抗小鼠IgG抗体或山羊抗兔IgG抗体，于室温轻摇1 h。二抗孵育结束后，用PBST漂洗膜后再浸洗3次，每次5～10 min。用HRP-ECL发光法按试剂盒步骤进行化学发光反应，并用凝胶图像处理系统分析目标条带的吸光度，并将膜片进行扫描或拍照。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人骨肉瘤MG-63细胞ADM耐药株的建立

采用ADM大剂量间隙作用法对人骨肉瘤MG-63细胞进行体外培养诱导，成功建立了对ADM耐药的细胞株MG-63/ADM（历时约70 d，可在2 μg/mL的ADM稳定生长）。

2.2 MTT法检测MG-63/ADM细胞的耐药性

采用MTT法检测MG-6组3及MG-63/ADM细胞组对ADM的IC50，发现MG-63/ADM细胞组的IC50（1.97±0.56）明显高于MG-63细胞组（0.16±0.07），同时MG-63/ADM组的RI（11.35）显著高于MG-63细胞组（1.00），差异均有统计学意义（P < 0.05）。

2.3 CMC对MG-63/ADM细胞增殖的影响

MTT结果显示，加入CMC后MG-63/ADM细胞+ADM组的细胞增殖明显被抑制，且在CMC浓度为50、100、200 μmol/L时，细胞生长抑制率随作用时间的延长而增加（F = 3.89、4.99、5.78，均P < 0.05）；在CMC作用24、48、72 h时，细胞生长抑制率随CMC浓度的升高而增加（F = 4.69、5.77、7.14，均P < 0.05）；CMC+ADM组与ADM组及CMC组比较，差异有统计学意义（F = 5.46、6.37、6.49，均P < 0.05）。见表1。

2.4 CMC对MG-63/ADM细胞中P-gp和细胞核中NF-κB P65表达的影响

Western blot结果表明，MG-63/ADM细胞组P-gp表达水平较MG-63细胞组表达明显上调（P < 0.05），且MG-63/ADM细胞组细胞核中NF-κB P65的表达水平较对照组MG-63细胞组明显上调（P < 0.05）。MG-63/ADM细胞+CMC组P-gp的表达水平较MG-63/ADM细胞组（不加药物）明显下调（P < 0.05），MG-63/ADM细胞+CMC组细胞核NF-κB P65的表达水平较MG-63/ADM细胞组明显下调（P < 0.05），且呈剂量依赖性。见表2，图1。

3 讨论

骨肉瘤多药耐药是该病复发转移的主要因素之一。体外研究其耐药机制及逆转方法的条件及基础是建立骨肉瘤的耐药细胞株。大量研究表明，通过持续诱导或大剂量间歇诱导等方法体外诱导建立骨肉瘤多药耐药细胞株是可行的[8-9]。大剂量间歇诱导法更接近临床化疗实际。因此，本研究采用了大剂量间歇诱导法。骨肉瘤化疗的主要药物包括铂类、蒽环类、达卡巴嗪等。其中，ADM是骨肉瘤最主要的化疗药物之一[11]。本研究根据文献采取了ADM大剂量间歇干预人骨肉瘤MG-63细胞进行体外诱导约70 d建立了MG-63/ADM，通过MTT法检测该组细胞耐药性，发现MG-63/ADM对ADM呈中度耐药，其IC50为（1.97±0.56）μg/mL，RI为11.35。提示该耐药株具有耐药性，说明成功诱导建立了对ADM耐药的人骨肉瘤耐药细胞MG-63/ADM。

CTS是自然界中的第二大生物资源，是广泛存在于甲壳类动物等生物组织中的一种天然高分子聚合物。其具有较好的生物相容性、生物可降解性、低毒性等特点，在药物载体、抗肿瘤、免疫调节等多方面显示出了良好的前景[12]。研究表明，CTS可抑制多种肿瘤细胞的增殖[13]。CMC是壳聚糖最常见的衍生物，经CTS醚化改性后的CMC具有更好的水溶性和生物相容性[14]。杨靖亚等[15]通过实验发现CMC可抑制Hela细胞和LS174-T细胞的增殖。张敏等[16]发现CMC可以抑制口腔癌及癌前病变细胞黏附和侵袭。CMC对多药耐药细胞，特别是对骨肉瘤多药耐药细胞的影响，目前鲜见报道。本研究显示，CMC可部分逆转人骨肉瘤MG-63/ADM耐药细胞株对ADM的耐药。

目前，已知的骨肉瘤多药耐药的产生机制主要有：化疗药物的排出增多，如P-gp的外排泵药机制；细胞解毒增强，如谷胱甘肽巯基转移酶（GST）的细胞解毒作用；细胞凋亡抑制；骨肉瘤干细胞；自噬相关化疗抵抗等机制相关[17-19]。其中P-gp介导的药物外排机制，是经典的多药耐药产生机制之一，但其具体调节过程及调节因素仍不完全明确。在多种耐药的肿瘤细胞系中存在着异常的NF-κB的表达[20]。朱文魏等[21]研究认为，NF-κB p65蛋白参与皮肤鳞状细胞癌的形成和发展，随患者病情的进展，NF-κB p65蛋白的阳性表达率越高。隋华等[22]发现，在人结肠HCT-116/L-OHP细胞中，NF-κB与ABCB1基因在启动子区域相结合，启动ABCB1基因的转录，引起P-gp的过表达，从而增强耐药。本研究结果显示，MG-63/ADM细胞组较MG-63细胞组P-gp表达明显上调，且细胞核NF-κB P65表达增加。推测在人骨肉瘤耐药细胞中，P-gp导致的耐药与NF-κB P65信号通路有关。

综上所述，CMC可逆转MG-63/ADM细胞耐药，即通过下调P-gp及NF-κB P65表达实现，推测CMC逆转骨肉瘤耐药机制可能与抑制细胞核NF-κB信号通路相关。

[参考文献]

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[2] 王文剑，于秀淳.局部复发性骨肉瘤临床治疗疗效的系统文献分析[J].中国骨与关节杂志，2017，6（6）：421-427.

[3] 易生辉，秦刚，黄肖华.新辅助化疗联合保肢手术治疗骨肉瘤疗效Meta分析[J].中医临床研究，2017，9（25）：139-141.

[4] 丰涛，沈赞.三氧化二砷对骨肉瘤细胞株MG-63/dox多药耐药的逆转作用及其机制[J].临床肿瘤学杂志，2016， 21（1）：6-11.

[5] 杨怀宇，武婷茹，刘俊希.甲壳素一壳聚糖的生理功能及应用研究进展[J].安徽农业科学，2015，43（18）：24-25.