‘鲁枣2号’和‘鲁枣6号’花药愈伤组织诱导及不定芽分化

关秋竹，张 琼，孙红雁，周广芳，孙清荣

枣(Ziziphus jujube Mill.)组培繁殖通常选择茎尖、茎段、叶片、胚、花药等作为外植体，目前已有枣树品种20个以上以各种类型的外植体建立了无菌离体繁殖体系［1～4］。通过花药培养获得愈伤组织和再生植株，可以为遗传育种研究提供重要材料。枣的花药培养开始于20世纪90年代，最初仅在金丝小枣上有过报道［5］。随后研究者们对枣花药愈伤组织的诱导及分化进行了研究［6，7］，并成功获得了几个枣品种花药再生植株，如‘长红枣’和‘金丝小枣’再生植株［8］;‘辣椒枣’和‘月光’枣源于花药壁的再生植株［9］;‘冬枣’单倍体2 株［9］;‘赞皇大枣’单倍体1 株［10］。‘鲁枣2 号’和‘鲁枣6 号’是由山东省果树研究所选育的新品种［11，12］，其花药培养尚未见报道。为了更好地利用、保存和改良这些品种，本次研究以前人报道为基础，通过正交实验设计，旨在建立枣的离体花药植株再生体系，为枣花药离体培养研究和单倍体育种提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

5月底至6月初，在山东省果树研究所枣树资源圃采集枣树新品种‘鲁枣2号’和‘鲁枣6号’绿色到黄绿色，且花萼尚未张开的幼嫩花蕾作为材料。

1.2 方法

1.2.1 花药愈伤组织的诱导 幼嫩花蕾置于4℃冰箱中1 d后，用流水冲洗0.5～1.0 h，控净水后置于超净工作台上的无菌烧杯内，用体积分数为0.70的酒精浸泡1 min，再用体积分数为0.05的次氯酸钠溶液杀菌15 min，无菌水冲洗3～4次后，剥取花药接种在愈伤组织诱导培养基上。愈伤组织诱导培养基采用MS，1/2 MS，1/4 MS培养基，附加葡萄糖、蔗糖、麦芽糖作为碳源(质量浓度均为30.0 g·L－1)，添加不同量的萘乙酸(NAA)及 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。NAA 设置 0.1，0.3，0.5 mg·L－13种质量浓度;2，4-D 设置0.5，1.0，1.5 mg·L－13种质量浓度。所选因素及其水平具体见表1。按 L9(34)正交试验表形成9种不同配方的培养基(表2)，所有培养基均添加琼脂，使其质量浓度达到6.0 g·L－1，在灭菌前调节pH值为5.8。每个处理接种3皿，每皿接种花药15～20个，3次重复。接种后置于(25±2)℃暗培养，5周后统计愈伤组织诱导率，观察记录愈伤组织生长状态。花药愈伤组织诱导率=［产生愈伤组织的花药数/接种总花药数］×100%

表1 ‘鲁枣2号’和‘鲁枣6号’花药愈伤组织诱导的因素及水平

1.2.2 花药愈伤组织的分化及不定芽伸长、增殖培养 将生长至0.5～1.0 cm的愈伤组织转至分化培养基中进行分化培养。分化培养基以MS和WPM为基本培养基，添加噻苯隆(TDZ)，2，4-D，吲哚乙酸(IAA)及赤霉素(GA3)。设置4种不同培养基处理(表3)，所有培养基均添加麦芽糖，其质量浓度达到20.0 g·L－1;琼脂质量浓度达到6.0 g·L－1。在灭菌前调节pH值到5.8。培养条件为光周期16 h/8 h(光/暗)，光强40μmol·(m2·s)－1，温度(25±2)℃。6周后，统计花药愈伤组织分化率。

选取生长正常、未玻璃化的不定芽转移到增殖培养基进行继代增殖和伸长培养。不定芽的增殖培养基为WPM，6-BA 的质量浓度4.0 mg·L－1，TDZ的质量浓度1.0 mg·L－1，附加蔗糖的质量浓度为30.0 g·L－1，琼脂的质量浓度为 6.0 g·L－1，在灭菌前调节 pH 值到 5.8。

2 结果与分析

2.1 花药愈伤组织的诱导

利用L9(34)正交设计筛选适宜的枣花药愈伤组织诱导培养基，5周后统计结果，并对正交试验结果进行直观分析(表2)。经极差分析，4个因素对‘鲁枣2号’及‘鲁枣6号’花药愈伤组织诱导均有影响，影响因素由大到小的排列顺序均为:C，D，A，B。即碳源因素对愈伤组织诱导影响最大，极差值分别为32.7(‘鲁枣2号’)和41.5(‘鲁枣6号’)，其次为基本培养基、NAA 和2，4-D。本次试验采用了 MS，1/2MS，1/4 MS 3种基本培养基，效果最好的是1/4 MS培养基;碳源因素方面，‘鲁枣2号’花药愈伤组织诱导率最高的是葡萄糖，其次是麦芽糖，但两者K值差异不大;‘鲁枣6号’诱导效果最好的是麦芽糖;2种激素中NAA对愈伤组织诱导的影响较大，NAA的质量浓度为0.3 mg·L－1的诱导效果较好，2，4-D影响效果较小。基本培养基、碳源和激素水平的不同，花药愈伤组织表现为不同的形态(表2)。可分为3种主要形态，分别为黄白色致密愈伤组织、褐色疏松愈伤组织和褐色致密愈伤组织。黄白色致密愈伤组织主要发生在以麦芽糖为碳源的培养基上;褐色疏松愈伤组织主要发生在以葡萄糖和蔗糖为碳源的培养基上;以蔗糖为碳源的培养基上还会产生一些褐色致密愈伤组织。

2.2 花药愈伤组织的分化

‘鲁枣2号’和‘鲁枣6号’的黄白色致密愈伤组织在分化培养基上均可以进行正常分化形成不定芽。首先愈伤组织顶部变绿，产生绿色或白色凸起(图1 A)，形成不定芽(图1 B，图1 C)，将不定芽转移至增殖培养基上，表现为既有伸长生长也有增殖生长(图1 E)。而褐色致密愈伤组织在分化培养过程中，愈伤组织顶部产生绿色、玻璃化的愈伤组织，可进一步分化形成玻璃化芽(图1 D)，玻璃化芽转至增殖培养基上，不能进行正常生长及增殖。褐色疏松型愈伤组织在后续培养的过程逐渐褐化死亡。

‘鲁枣2号’黄白色致密愈伤组织在分化培养基①和②上均不能分化，在分化培养基③和④上则能较好的实现分化，分化率分别为80%(分化培养基③)和100%(分化培养基④)(表3)。鲁枣6号黄白色致密愈伤组织在分化培养基①，③和④上均能实现分化，分化率最高为50%(分化培养基③)(表3)。

表2 ‘鲁枣2号’和‘鲁枣6号’花药愈伤组织诱导的正交试验结果直观分析

图1 ‘鲁枣6号’花药愈伤组织诱导芽的分化及增殖

表3 不同类型花药愈伤组织的分化情况

3 结论与讨论

本次试验利用L9(34)正交设计筛选获得了适宜‘鲁枣2号’和‘鲁枣6号’花药愈伤组织诱导的培养基。对愈伤组织诱导率，‘鲁枣2号’的最优组合为:C2D3A2B3;‘鲁枣6号’的最优组合为:C3D3A2B3。对愈伤组织类型，以蔗糖为碳源时，‘鲁枣2号’虽然可获得较高的花药愈伤组织诱导率，但得到的愈伤组织多为褐色致密或疏松型愈伤组织，后续培养过程中或死亡，或转入分化培养基后进行分化，但多形成玻璃化不定芽，无法正常伸长及增殖。因此，‘鲁枣2号’和‘鲁枣6号’花药愈伤组织诱导培养基的最优组合均应为:C3D3A2B3，即1/4 MS，NAA的质量浓度0.3 mg·L－1，2，4-D的质量浓度1.5 mg·L－1，麦芽糖的质量浓度30.0 g·L－1。正交试验结果的直观分析表明，实验所选4个影响因素中，碳源的种类对花药愈伤组织诱导率的影响最大。与前人在冬枣上的研究结果一致［7～9，13］，本次试验结果表明，麦芽糖是‘鲁枣2号’和‘鲁枣6号’花药愈伤组织培养的最适碳源。以麦芽糖为碳源，不但获到较高的愈伤组织诱导率，且愈伤组织形态好，分化效率高。韩晶等［9］也在‘金丝小枣’和‘长红枣’花药培养中，以麦芽糖为碳源，诱导得到了黄白色、致密的愈伤组织。进一步的愈伤组织分化试验表明，黄白色致密愈伤组织具有较强的分化能力，且能够分化得到正常不定芽，在分化培养基MS，TDZ的质量浓度0.1 mg·L－1，IAA 的质量浓度0.1 mg·L－1，GA3的质量浓度 1.0 mg·L－1和培养基 WPM，KT 的质量浓度 0.2 mg·L－1，IAA 的质量浓度0.5 mg·L－1，GA3的质量浓度1.0 mg·L－1上分化率均较高且差异不显著;褐色致密愈伤组织转入分化培养基后也能进行分化，但多形成玻璃化不定芽;在黄白色致密型愈伤组织分化过程中也有一定比例玻璃化不定芽的出现(数据未列出)。武晓红［13］在对冬枣等5个枣品种的花药愈伤组织分化的研究中发现，添加三十烷醇的分化培养基上的愈伤组织分化率较高，但多以玻璃化植株为主。韩晶等［14］对玻璃化苗适宜的继代培养基和玻璃化苗的复壮条件进行了研究，认为添加聚乙烯醇、降低培养温度、使用封口膜等措施都有利于玻璃化苗的复壮。关于如何防止枣花药愈伤组织分化过程中玻璃化现象的发生还有待进一步研究。

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