检测调味料中罂粟碱壳成分的样品制备方法的改进

, , , , , * (. 中国食品药品检定研究院, 北京 00050; . 辽宁省食品检验检测院, 沈阳 005)

在日常监管中,食品理化检验主要包括质量检验和安全性检验,其中质量检验主要针对的是食品中品质指标、污染物指标和带入或者工艺衍生的风险性指标;安全检验主要针对的是食品中可能存在的风险物质、超范围添加成分和非食用物质等方面的内容。两类检验均存在检测指标分布不均一、检测浓度范围宽泛、检测对象多样、目标物质存在基体多样性等特点。通常食品检测的不确定度来源主要包含样品预处理、样品制备及样品检测等3个方面[1-3],其中样品预处理及样品制备也可以统一为样品处理。研究[4-8]表明,食品分析中样品处理和检测分别带入的不确定度占比中,样品处理通常占有75%以上的份额,而样品的检测则只占有10%～20%的份额。随着检测设备的灵敏度和检测能力的提高,来源于样品检测的不确定度逐步减小,影响食品检测的主要不确定度来源为样品处理。

样品的制备技术[5-11]主要有液液萃取、液固萃取、固相萃取、定量转化、消解等等,一般对于微量或者痕量成分,常采用富集或者浓缩的方式以提高其检出效率,在检测过程中存在物质或者溶剂转移和替换等步骤,带来的检测目标损失包括吸附、分配、转移、反应等方面的损失[12-15]。在现代样品分析中,有研究[16-22]提出减少处理步骤和同一提取净化体系等方式,以减少相关损失,提高回收率。本工作建立一种快速样品制备方法,对样品进行超细粉碎处理,添加溶剂进行提取,加入惰性陶瓷砂,以超细粉碎离心器进行离心粉碎后离心,将上清液转移入装有少量C18的进样瓶外管中,混匀后,套入附有滤膜内管,直接过滤上机检测。方法以高效液相色谱-串联质谱法测定调味料中的5种罂粟碱壳成分为例,通过与常规样品处理方法进行比较,来验证方法的有效性。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

Waters XEVO TQ-S三重四极杆串联质谱仪,配超高效液相色谱仪;Milli-Q型超纯水仪;CF16RXⅡ型离心机;自制小型超细粉碎离心机。

标准储备溶液:1.00 g·L-1,分别称取盐酸罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡和磷酸可待因对照品适量,用0.1%(体积分数,下同)甲酸的甲醇溶液溶解并稀释配制而成。使用时,配制成罂粟碱、那可丁和蒂巴因的质量浓度为50 mg·L-1,吗啡和磷酸可待因质量浓度为250 mg·L-1的混合标准溶液。

吗啡-D3、可待因-D3内标溶液:5.0 mg·L-1,介质为甲醇。

盐酸罂粟碱、吗啡、那可丁、磷酸可待因、蒂巴因对照品。

乙腈、甲醇为色谱纯;甲酸为质谱纯;盐酸、氢氧化钠、乙酸钠、甲酸铵、硫酸镁为分析纯;N-丙基乙二胺(PSA,粒度50～80 μm)、C18(粒度40～80 μm)填料。

1．2 仪器工作条件

1) 色谱条件 Waters BEH HILIC色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),柱温40 ℃;进样量5 μL;流量0.2 mL·min-1;流动相A为乙腈,B为含0.1%(体积分数,下同)甲酸溶液。梯度洗脱程序:0～0.5 min时,A为95%;0.5～2.5 min时,A由95%降至70%;2.6～4.0 min时,A为40%;4.0～6.0 min时,A为95%。

2) 质谱条件 电喷雾正离子源;多反应监测(MRM)模式;毛细管电压3.5 kV;离子源温度150 ℃,去溶剂气温度400 ℃;去溶剂气流量800 L·h-1;锥孔气流量30 L·h-1;碰撞气为氩气,碰撞气压0.376 Pa。各物质的定性、定量离子及碰撞能量见表1。

表1 质谱条件Tab. 1 MS parameters

1．3 试验方法

1．3．1 常规样品前处理方法

称取试样2.000 0 g于50 mL聚四氟乙烯具塞离心管中,加入内标溶液150 μL,再加入0.1 mol·L-1盐酸溶液5 mL,超声处理30 min,加入乙腈15 mL,涡旋振荡1 min,加入无水硫酸镁6 g和无水乙酸钠1.5 g的混合粉末,迅速振摇,涡旋振荡1 min,以5 000 r·min-1转速离心5 min,取上清液待净化。

称取(50±5) mg的PSA、(100±5) mg的无水硫酸镁、(100±5) mg的C18粉末置于2 mL聚四氟乙烯具塞离心管中,移取上清液1.5 mL至此离心管中,涡旋混合1 min,以10 000 r·min-1转速离心2 min,移取上清液,经0.22 μm滤膜过滤,待测。

1．3．2 快速样品制备方法

称取试样2.000 0 g于50 mL聚四氟乙烯具塞离心管中,加入内标溶液150 μL,加入含0.1%甲酸的乙腈5 mL,加入惰性陶瓷砂0.2 g,以超细离心粉碎器进行离心粉碎5 min,转速为5 000 r·min-1。取出,以10 000 r·min-1转速离心10 min,取上清液1.2 mL于已装入0.1 g左右C18填料的进样瓶外管中,混匀后,插入带有滤膜的内插管,盖好进样瓶盖,放入进样器,待测。

2 结果与讨论

2．1 快速制备样品方法的建立

为更好地比较快速样品制备方法,选择的常规样品处理方法为改良的QuEChERS技术,也属于近年来较为流行用于快速前处理的方式。

快速样品制备包括样品的超细粉碎、提取、离心和过滤等几个步骤,与常规方法不同的是,样品提取经过与惰性陶瓷的碰撞摩擦,增加了样品的粉碎和接触程度。液体和固体样品均采用相同的方式进行,其中液体样品由于经过该步骤增加了相关物质的接触,同时由于摩擦升高温度,提高了提取效率。该制备方法采用的超细粉碎离心机,见图1,后期采用的进样瓶参见图2。

图1 超细粉碎离心机的构造简图Fig. 1 Structure diagram of the superfine crushing centrifuge

图2 样品瓶构造简图Fig. 2 Structure diagram of the vial

图1所示的超细粉碎离心机主要对离心机内壁、离心转子构造进行了设计:内壁采用聚四氟乙烯内面,均匀塑造成波浪式表面;离子转子采用的杆型设计,套入离心管,离心时,管外端可以接触到离心机内壁,在振荡下,产生样品和内置陶瓷砂的摩擦以粉碎样品。图2所示的样品瓶主要按照现有1.5 mL或者2 mL进样瓶进行了设计,包括内外两个部分:外部套管可移入提取后的样品溶液,管内可预先放置少量C18填料,用于样品溶液的净化,待溶液和少量填料混匀后,插入内管,内管的下部有0.22 μm尼龙滤膜,可以过滤溶液,插入后进入内管的溶液可以直接上机测定。

2．2 工作曲线、检出限与测定下限

称取阴性样品2.000 g,加入内标溶液150 μL,再加入混合标准溶液,按试验方法配制5种罂粟碱壳的基质标准溶液系列并进行测定,以罂粟碱、那可丁和蒂巴因的质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制工作曲线,以外标法定量;以吗啡和可待因的峰面积与相应内标物峰面积的比值为纵坐标,吗啡和可待因的质量浓度为横坐标绘制工作曲线,以内标法定量。2种样品制备方法得到的线性范围和线性回归方程见表2。

分别以3倍信噪比和10倍信噪比计算检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),结果见表2。

表2 2种样品制备方法得到的线性参数、检出限及测定下限Tab. 2 Linearity parameters, detection limits and the lower limits of determination of the two methods for sample preparation

由表2可知:本法所得线性回归方程的斜率明显高于常规方法,同时回归曲线的截距相当;比较测定下限和检出限可知,本法比常规方法的灵敏度高。

2．3 精密度与回收试验

在低、中、高等3个浓度水平进行加标回收试验,加标回收率在75%以上。精密度包括日间和日内精密度,5种物质在6次平行测定下,相对标准偏差为5%～10%。说明本法可以满足食品检测的要求。

2．4 样品分析

对市售的5批固体调味料和5批液体调味料进行检测,按照常规样品制备方法,固体调味料中检出1批次的阳性样品(罂粟碱),液体调味料中均为阴性样品。而通过快速样品制备方法后,5批固体样品中检出2批次阳性样品(罂粟碱、吗啡),液体样品中检出1批次阳性样品(吗啡)。对结果进行进一步分析,液体样品的检出主要是由于方法整体灵敏度的提高,而固体样品中另外一批次样品(吗啡)的检出,是由于在常规制备方法中固体样品的粉碎程度不够,没有得到很好的提取。在进一步粉碎和超声提取后沿用常规制备的方法进行检测,发现可以检出,但是测定值比快速样品制备方法低,说明快速制备方法具有更好的适用性,减少了假阴性的检测结果。

本工作提出了超细粉碎提取、简单净化的样品前处理方法,可以用于部分食品样品中风险物质的检测。方法进一步减少了样品的处理步骤和试剂的添加,减少了步骤中的转移吸附损失,可以为食品风险物质的灵敏检测提供途径。

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