黄芩茎叶黄酮抑制冈田酸引起大鼠脑内PHF异常生成和蛋白磷酸酶的调节机制*

王小青， 高 杨， 董永彩， 商亚珍△

(1河北省中医药抗痴呆重点研究室， 河北省中药研究与开发重点实验室， 承德医学院中药研究所， 2承德钢铁集团有限公司总医院， 河北 承德 067000)

神经退行性疾病是大脑和脊髓的细胞神经元丧失的疾病状态，随着世界人口老龄化的日益加重，该病发病率逐年增加，当今已经成为继心血管疾病、肿瘤和脑卒中之后老年人的第4大死亡原因[1]。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是最常见的神经退行性疾病，其主要临床症状是记忆渐进性减退，神经病理上脑内神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)和老年斑(senile plaques，SPs)的形成被认为是最主要的发病原因。NFTs是由胞内微管相关蛋白tau高度磷酸化形成的双螺旋细丝(paired helical filaments，PHFs)积聚而成[2]。到目前为止，导致PHFs生成的内在机制还不完全清楚，普遍认为其可能与蛋白磷酸酶(protein phosphatase，PP)调节失衡有关。蛋白磷酸酶2A(PP2A)对tau蛋白的脱磷酸化作用占所有相关的蛋白磷酸酶作用的70%，而蛋白磷酸酶1(PP1)和蛋白磷酸酶2B(PP2B)等的作用则仅占到10%甚至更少[3]。另外，有报道表明抑制小鼠脑内蛋白磷酸酶2C(PP2C)的活性可以减轻高胆固醇引起小鼠神经毒性反应[4]。在AD病人脑中蛋白磷酸酶活性显著降低，因此，上调蛋白磷酸酶活性，增加磷酸化tau蛋白脱磷酸化、减少磷酸化tau蛋白含量，阻止PHF在神经元内形成NFT可能会成为治疗AD的重要手段之一。

文献报道，脑内注射冈田酸(okadaic acid，OA)特异性地抑制PP1和PP2A的活性，可引起记忆障碍并伴随神经病理学改变，包括海马神经变性、tau蛋白配对的螺旋丝样磷酸化以及形成含有β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)的斑块状结构，并且实验证明其能使tau蛋白过度磷酸化从而很好的模拟AD样病理学特征[5]。

黄芩茎叶黄酮(flavonoids from stem and leaf ofScutellariabaicalonsisGeorgi，SSF)是从黄芩地上部分分离的黄酮类化合物，以往研究已经证明，SSF具有较强的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降压、降血脂、解热、镇痛及调节自由基和能量代谢的作用，能够改善氯化铝(AlCl3)、D-半乳糖、β-淀粉样蛋白和慢性脑缺血等引起的实验动物学习记忆障碍[6-10]，但对OA所致大鼠脑内PHF异常生成及相关蛋白磷酸酶的影响尚未见报道。本实验利用大鼠侧脑室注射OA建立大鼠记忆障碍模型，探讨SSF对OA诱导的PHF异常生成及PP1、PP2A-Cα、PP2A-Cβ、PP2CA和PP2CB蛋白表达的影响，研究上述蛋白磷酸酶在SSF抑制PHF异常生成中的调节机制。

材 料 和 方 法

1 实验动物和试剂

雄性清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重250～300 g，由河北医科大学实验动物中心提供，动物许可证号为810034。

冈田酸购于Sigma；SSF由承德医学院中药研究所提供，纯度为87.11%；RIPA组织/细胞裂解液和PMSF购自北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购于碧云天生物技术公司；预染蛋白marker购于Thermo；抗PHF、PP1、PP2A-Cα，PP2A-Cβ、PP2CA和PP2CB抗体购于北京博奥森生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购于中杉金桥生物技术有限公司；ECL超敏发光液试剂盒购于北京普利来基因技术有限公司；阳性对照药银杏叶黄酮(GinKgobilobaleaf flavonoids，GLF)由贵州信邦制药有限公司提供。

2 实验方法

2.1大鼠记忆障碍模型的建立和筛选 健康雄性SD大鼠，实验室适应性饲养1周，术前禁食12 h。腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，常规消毒，固定于大鼠脑立体定位仪，颅顶正中矢状切开，暴露硬脑膜，标记前囟点位置。参照包新民编著《大鼠脑立体定位图谱》，以前囟点为坐标原点，于前囟点后0.8 mm和中线右侧旁开1.3 mm确认入针点，三棱锥钻一直径为0.2 mm的孔，将带内芯的穿刺套管从进针点垂直插入3.5 mm，缓慢旋出导管内芯，见脑脊液溢出后把内芯置回。以牙托粉固定穿刺套管，缝合头部皮肤并消毒，将200 ng/kg OA(10% DMSO溶解配制)分2次注入，2次注射时间间隔3 d。假手术(sham)组大鼠做同样手术但脑室注入等体积的含10% DMSO的生理盐水溶液。第2次注射后，每笼4只大鼠恢复饲养21 d，用Morris水迷宫训练进行筛选，以第4天水迷宫训练成绩作为痴呆模型成模标准[8,11]。

2.2实验动物分组及样品制备 将40只造模成功大鼠随机分为5组，模型(model)组、25、50和100 mg/kg SSF 3个剂量SSF(分别为SSF25、SSF50和SSF100)组和GLF组。3个剂量SSF组和GLF组大鼠分别连续灌胃SSF 25、50和100 mg/kg及GLF 200 mg/kg 36 d(每天1次)，假手术组和模型组取等体积蒸馏水灌胃。SSF先用饱和碳酸氢钠溶解，使药液pH为7.2～7.4，再用蒸馏水稀释到所需浓度。大鼠手术后第65天，即给药第36天，所有大鼠在给药后60 min乙醚麻醉，断头处死，冰上分离大脑皮层与海马组织，称重迅速放在1.5 mL无RNA酶的EP管中，冻存于-80 ℃超低温冰柜中备用。

2.3Western blot法检测大鼠大脑皮层与海马中PHF及PP1、PP2A-Cα、PP2A-Cβ、PP2CA和PP2CB的蛋白表达 将冻存的各组大鼠皮层与海马组织用匀浆器冰上匀浆，用RIPA裂解液提取相应组织总蛋白，BCA法测定样品蛋白浓度。在蛋白样品中加入5×上样缓冲液，100 ℃沸水变性3 min。在12% SDS-PAG中用120 V恒压电泳分离蛋白，250 mA恒流湿转膜2 h，将蛋白转移至PVDF膜。5% 脱脂奶粉溶液封闭2 h，分别加入抗PHF、PP1、PP2A-Cα、PP2A-Cβ、PP2CA和PP2CB的I抗(1∶500)4 ℃过夜，用TBST缓冲液漂洗5次，每次5 min，分别加入相应的II抗孵育2 h，TBST 缓冲液漂洗5次，每次5 min。使用ECL化学发光剂进行曝光并显影。胶片扫描后采用 Quantity One 4.6.2 软件对显影条带进行分析，以目的蛋白与内参照β-actin蛋白的灰度比值作为目的蛋白的相对表达量。

3 统计学处理

利用SPSS 19.0统计学软件进行统计学分析，GraphPad Prism 5.0作图，所有数据用均数±标准差(mean±SD)表示。多样本均数间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐组按照Bonferroni检验，方差不齐组按照Games-Howell检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠记忆障碍模型筛选

Morris水迷宫训练中随着训练天数的延长，所有大鼠找到平台的潜伏期都逐渐降低，且假手术组大鼠找到平台的潜伏期明显低于脑室注射OA大鼠。根据第4天每只脑室注射OA大鼠与假手术组大鼠的成功筛选率(screeing ratio，SR)大于0.2计算，本实验大鼠存活率和模型成功率分别为95%和81.67%[12]。

2 SSF对各组大鼠皮层与海马中PHF和蛋白磷酸酶蛋白表达的影响

大鼠侧脑室注射OA(200 ng/Kg)建立记忆障碍模型，模型成功后分别用25、50和100 mg/kg SSF灌胃36 d，采用Western blot法测定大鼠大脑皮层与海马组织中PHF、PP1、PP2A-Cα、PP2A-Cβ、PP2CA和PP2CB的蛋白表达，GLF作为阳性对照药，上述蛋白的Western blot结果见图1。

Figure 1. The effects of SSF on the expression of PHF and protein phosphatase in rat cortex and hippocampus induced by OA.

图1SSF对各组大鼠皮层与海马中PHF和蛋白磷酸酶表达的影响

2.1SSF 对各组大鼠皮层与海马中PHF蛋白表达量的影响 与假手术组比较， 侧脑室注射OA(200 ng/kg)可使大鼠皮层与海马中PHF的蛋白表达量均明显增加(P<0.01)；与模型组相比，3个剂量的SSF不同程度地逆转OA所引起的大鼠皮层与海马中PHF的蛋白表达的增加(P<0.01)； GLF也表现出与SSF类似的作用结果，PHF蛋白表达量均降低(P<0.01)，见图2。

2.2SSF对各组大鼠皮层与海马中PP1蛋白表达量的影响 Western blot实验结果显示，与假手术组相比，侧脑室注射OA(200 ng/kg)可使大鼠皮层中PP1的蛋白表达显著降低(P<0.05)；与模型组相比，3个剂量的 SSF给药36 d后模型大鼠皮层中PP1的蛋白均增加(P<0.05)，GLF亦使大鼠皮层中PP1蛋白表达量升高(P<0.01)。但SSF及GLF对大鼠海马中PP1蛋白表达量无显著性影响，见图3。

Figure 2. The effects of SSF on the expression of PHF in rat cortex and hippocampus induced by OA. Mean±SD.n=6.##P<0.01vssham group;**P<0.01vsmodel group.

图2SSF对OA诱导的大鼠皮层与海马中PHF蛋白表达量的影响

Figure 3. The effects of SSF on the expression of PP1 in rat cortex and hippocampus induced by OA. Mean±SD.n=6.#P<0.05vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

图3SSF对OA诱导的大鼠皮层与海马中PP1蛋白表达量的影响

2.3SSF对各组大鼠皮层与海马中PP2A-Cα和PP2A-Cβ蛋白表达量的影响 侧脑室注射OA(200 ng/kg)可减少大鼠脑中PP2A-Cα和PP2A-Cβ的蛋白表达，与假手术组相比，model组大鼠皮层和海马中PP2A-Cα和PP2A-Cβ蛋白表达均降低(P<0.05)；灌胃给予SSF 25、50 和 100 mg/kg治疗36 d均可逆转OA引起的大鼠皮层与海马中PP2A-Cα和PP2A-Cβ蛋白表达的降低(P<0.01)； GLF具有与SSF类似的结果，使大鼠皮层与海马中PP2A-Cα和PP2A-Cβ蛋白表达均增加(P<0.01)，见图4、5。

Figure 4. The effects of SSF on the expression of PP2A-Cα in rat cortex and hippocampus induced by OA. Mean±SD.n=6.##P<0.01vssham group;**P<0.01vsmodel group.

图4SSF对OA诱导的大鼠皮层与海马中PP2A-Cα蛋白表达量的影响

Figure 5. The effects of SSF on the expression of PP2A-Cβ in rat cortex and hippocampus induced by OA. mean±SD.n=6.#P<0.05,##P<0.01vssham group;**P<0.01vsmodel group.

图5SSF对OA诱导的大鼠皮层与海马中PP2A-Cβ蛋白表达量的影响

2.4SSF对各组大鼠皮层与海马中PP2CA蛋白表达量的影响 Western blot显示，与假手术组相比，侧脑室注射OA(200 ng/kg)可显著增加大鼠皮层中PP2CA的蛋白含量(P<0.01)； 与模型组相比，100 mg/kg SSF可增加大鼠皮层中PP2CA的表达(P<0.01); GLF也表现出与SSF类似的作用结果，与model组相比，皮层PP2CA蛋白表达量升高(P<0.01),见图6。

Figure 6. The effects of SSF on the expression of PP2CA in rat cortex and hippocampus induced by OA. Mean±SD.n=6.##P<0.01vssham group;**P<0.01vsmodel group.

图6SSF对OA诱导的大鼠皮层与海马中PP2CA蛋白表达量的影响

2.6SSF对各组大鼠皮层与海马中PP2CB蛋白表达量的影响 与假手术组相比，侧脑室注射OA(200 ng/kg)可增加大鼠皮层中PP2CB的蛋白含量(P<0.01)，降低海马中PP2CB的蛋白含量(P<0.01)；与模型组相比，3个剂量SSF治疗36 d可不同程度地调节OA引起的大鼠皮层与海马中PP2CB的蛋白表达， 其中，50和100 mg/kg SSF可显著提高皮层中PP2CB的表达(P<0.01)，而100 mg/kg SSF显著降低海马中PP2CB的表达(P<0.05)， GLF呈现相似的作用，与模型组相比，GLF组PP2CB皮层蛋白表达量升高(P<0.01)，海马蛋白表达量降低(P<0.05)，见图7。

讨 论

Tau蛋白是神经细胞主要的微管相关蛋白，其对促进微管形成和稳定微管系统起着重要作用。在AD患者脑中tau蛋白发生过度磷酸化，使tau蛋白丧失了其正常生理学功能，并积聚形成PHF，PHF具有极强的神经毒性，它们主要沉积在神经元轴突，也存在于神经元胞体，大量PHF聚合而成的NFT可诱导神经元受损及变性，干扰神经信号传导，进而导致神经结构与功能障碍。Tau蛋白异常磷酸化是造成痴呆的主要原因之一，与AD患者临床痴呆程度呈正相关。OA是一种称为腹泻性贝毒的天然毒素，它由38碳聚醚脂肪酸构成，能够渗透细胞膜进入细胞质，与PP2A-C L7环序列CYRCG结合， 抑制PP2A活性[13]。OA可诱导离体培养的海马神经元中tau蛋白过度磷酸化，在体内能促进Aβ沉积，造成神经元退化，突触缺失及记忆障碍，产生类AD样病理特征， 已成为研究AD疾病过程的常用工具药[14]。

Figure 7. The effects of SSF on the expression of PP2CB in rat cortex and hippocampus induced by OA. Mean±SD.n=6.##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

图7SSF对OA引起大鼠皮层与海马中PP2CB蛋白表达量的影响

前期研究发现，SSF可改善OA引起的神经元损伤，减少Aβ1-40和丙二醛沉积，增强胶质纤维酸性蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶和乳酸脱氢酶活性[9]。本研究发现，脑室注射OA可引起大鼠皮层与海马中PHF显著升高，而3个剂量SSF不同程度地降低大鼠脑内PHF表达，据此，SSF可作为治疗AD的候选药物。

AD患者脑中PHF异常生成与蛋白磷酸酶下调有关[15]，根据底物蛋白分子上磷酸化的氨基酸残基的种类，可将蛋白磷酸酶分为3类：丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)型蛋白磷酸酶(PPP)、Mg2+依赖性Ser/Thr型蛋白磷酸酶(PPM)和Tyr型蛋白磷酸酶(PTP)。另外，根据其底物特异性、对抑制物的敏感程度以及对不同离子的需求，可将Ser/Thr型蛋白磷酸酶分成4类：1型、2A型、2B型和2C型，分别用PP1、PP2A、PP2B和PP2C代表。PP1、PP2A和PP2B在结构上有较大的相似性，编码这3个亚族的基因都属于PPP基因家族，研究显示PPP与tau蛋白磷酸化关系最为密切[16]。

PP1为Ser/Thr型蛋白磷酸酶，特异性地集中在神经元树突棘内[17]，其主要作用于磷酸酶激酶的β亚单位，对哺乳动物磷酸酶激酶亚基的脱磷酸化活力较高，受内源蛋白抑制物1、2(inhibltor-1、2，I-1、2)的抑制[18]。有研究发现， PP1必需与ATP/Mg2+孵育后方可被糖原合成酶激酶3激活，大脑中ATP/Mg依赖的PPl，通过I-2的磷酸化作用而使PP1有活性[18]。本研究发现，大鼠脑室注射OA可引起PP1蛋白表达的降低，与OA为PP1特异性抑制剂相符，而3个剂量的SSF可显著升高大鼠皮层中PP1的蛋白表达，由此可见，SSF可以逆转OA导致的PP1活性降低。

PP2A是参与tau蛋白磷酸化的关键酶之一[13]，在tau蛋白脱磷酸化中发挥着非常重要的作用，PP2A作用于蛋白磷酸激酶的α亚单位，且不受I-1和I-2的抑制。PP2A以核心酶和全酶2种形式存在。核心酶由65 kD的结构亚基A(PP2A-A)与36 kD的催化亚基C(PP2A-C)构成，另有分子量为50～130 kD 不等的调节亚基B(PP2A-B)与核心酶结合形成三聚体的全酶。催化亚单位PP2A-C由309个氨基酸组成，分子量为36 kD，以Cα和Cβ两个异构体存在，由相应的基因编码，它们的序列相似有97%。在哺乳动物的心脏和大脑中PP2A-C高度表达，并且主要是分布在细胞质和核中，Lammers等[19]报道PP2A-C可以不依赖于A、B亚基而启动蛋白质翻译与终止来维持PP2A活性。本研究发现，大鼠侧脑室注射OA可使PP2A-Cα与PP2A-Cβ表达显著降低，与OA可特异性抑制PP2A活性有关，3个剂量SSF均不同程度地增加了PP2A-Cα与PP2A-Cβ在大鼠皮层与海马中的表达，由此可知，SSF可逆转OA导致的PP2A活性降低。

PP2C是Mg2+/Mn2+依赖性单体酶，其在细胞质、细胞核或线粒体中具有特定的位置[20]。由于它们是唯一的金属依赖类型的PP，它们也被称为PPM，与其他3个亚族关系较远，有着不同的进化背景，可控制哺乳动物细胞和植物中的应激信号通路。Jones等[21]表明，PPM1A(PP2CA)和PPM1B(PP2CB)蛋白的膜结合需要N-肉豆蔻酰化，也可能用于识别其生理目标，另外， Lu等[4]报道，槲皮素可抑制高胆固醇诱导的小鼠脑中PP2C的表达，从而减少相关小鼠的神经毒性。本研究发现，脑室注射OA使大鼠皮层中PP2CA和PP2CB蛋白表达升高，而海马中PP2CA蛋白表达变化较小，而3个剂量的SSF并未逆转OA对PP2CA及PP2CB蛋白表达的影响。

除海马中PP1外，GLF的作用皆与SSF相似，但从量效关系上讲，SSF的作用远远高于GLF。综上所述，SSF抑制OA大鼠脑内PHF蛋白表达，可能是通过调节皮层与海马区PP1、PP2A-Cα及PP2A-Cβ活性来共同完成的。

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