鸡传染性支气管炎病毒血清学和分子生物学检测技术研究进展

庄金秋，阮 震，张 颖，梅建国，苗立中

（1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600；2.滨州市滨城区里则街道办事处畜牧兽医工作站，山东滨州 256656）

鸡传染性支气管炎（Avian infectious bronchitis，IB）是由冠状病毒科冠状病毒属的鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触性、呼吸道传染病。IB呈世界性流行，是危害养禽业发展的重大传染病之一，给世界养禽业造成了严重的经济损失。目前，已发现IBV有30多种血清型，且常与其他病原发生混合或继发感染，从而给IBV检测增加了难度。为快速准确检测IBV，从血清学和分子生物学方面开发检测技术，是目前IB防控研究的重要内容。

1 血清学检测技术

1.1 血凝和血凝抑制试验（HA&HI）

HA&HI主要用于IBV抗原及抗体的检测。陆苹等[1]用1%胰蛋白酶处理后的尿囊液，来制备抗原，从而提高了检测的灵敏性和特异性。由于HI抗原制作过程繁琐，抗原效价不稳定，病毒浓度与HA滴度无线性关系，HI滴度与保护力在免疫期内无相关性，故该方法还无法应用于IBV的免疫监测。

1.2 琼脂扩散试验（AGP）

AGP操作简便、快速、特异性强、要求条件低、费用小，已被广泛应用于IBV抗体检测。杜恩歧等[2]用IBV LX4毒株N基因进行诱导表达获得包涵体，纯化蛋白后免疫所得多抗与不同型毒株进行AGP，发现该抗体可与不同毒株发生反应，说明重组蛋白可作为群特异性诊断抗原用于IBV诊断。但由于AGP敏感性差，以及不能区分疫苗株和感染毒株，因而实际应用受到一定限制。

1.3 病毒中和试验（VN）

VN是鉴定IBV的经典方法，可在鸡胚、鸡胚肾细胞或气管环培养物上进行，多用于IBV野毒株的分离、鉴定和分型。秦卓明等[3]用气管环交叉VN试验，对IBV山东分离株的血清型进行了鉴定并获得成功。虽然该方法的灵敏性和特异性均较好，但操作复杂，耗时长，且必须在较高要求的实验室条件下进行。

1.4 荧光抗体技术（FA）

FA主要用于IBV抗原、抗体检测及抗原组织定位。20世纪90年代已有多人对该方法进行了研究，并获得了满意结果。IBV感染SPF鸡7 d后，应用IFA对其不同脏器进行跟踪检测发现，在气管、肾脏、脾脏、肺脏和肝脏等组织细胞中均不同程度地出现特异性荧光。FA方法虽然直观、特异，抗原定位独特，但需荧光显微镜及较严格的时间限制。

1.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）

1.5.1 间接ELISA 间接ELISA主要用于IgM和IgG抗体检测。付润饶[4]、郑卫峰等[5]先后建立了IBV全病毒抗原间接ELISA方法，用于疫苗免疫后鸡血清中特异性抗体检测。李广兴等[6]以IBV重组表达的N蛋白为包被抗原，建立了检测IBV抗体的间接ELISA方法，为IBV快速诊断和流行病学研究奠定了基础。孙罗美等[7]、苗立中等[8]先后以IBV重组表达的S1蛋白为包被抗原，建立了检测IBV抗体的间接ELISA方法。Ding等[9]人工合成了选自IBV的S、M和N蛋白多片段抗原作为包被抗原，建立了检测IBV抗体的间接ELISA。间接ELISA为IBV的免疫抗体监测、临床野毒感染快速诊断和流行病学调查提供了一种敏感、特异、高通量的检测技术。

1.5.2 斑点ELISA（Dot-ELISA） 该方法以硝酸纤维素膜等固相化基质膜为载体，用于抗原、抗体检测，早在20世纪90年代末就已建立。阎芳等[10]将Dot-ELISA与生物素、亲和素系统相结合，建立了IBV ABC-Dot-ELISA方法，对自然感染和人工感染的病料的检出效果较好，检出率分别达到70%和85%左右，显著高于AGP。

1.5.3 夹心及双抗夹心ELISA 该方法分别利用多克隆抗体、单克隆抗体（MAb）作为一抗、二抗，并采用标记抗鼠IgG为指示系统，用于IBV早期感染的抗原检测，并且可以区分病毒株或血清型，适合于病料和感染鸡胚尿囊液的IBV检测。王林川等[11]认为单抗包被反应板要优于多抗、病毒包被反应板。季文彬[12]建立的双抗体夹心ELISA特异性好，可重复检测，结果可靠，为IB防控提供了良好的诊断方法。

1.5.4 捕获ELISA 白妍[13]利用制备的IBV B11株单抗，成功建立和优化了抗原捕获ELISA方法。该方法具有很好的敏感性和特异性，适合大规模样本的快速检测。

1.6 胶体金免疫层析技术（GICA）

王泽霖等[14]建立的对IBV银加强金标免疫检测技术（SECGA）不需特殊设备，检测快速、简便，是较有前途的新检测技术，但对金标二抗的浓度和活性要求很高。苏磊等[15]建立的IBV免疫胶体金诊断试纸条技术的特异性、灵敏性、稳定性均比IBV双抗夹心ELISA要高，且所需时间短，15 min后即可判定结果。郑卫峰[16]成功制备了IBV免疫胶体金快速检测试纸条，为IB的早期诊断和防治，以及与其它禽类呼吸道感染的快速鉴别提供了有力的技术手段。

2 分子生物学检测方法

2.1 RT-PCR

RT-PCR方法具有敏感、特异、快速等优点，既可利用通用引物检测不同来源、不同血清型的IBV，对于某些差异较大的毒株，也可通过设计型特异性引物来区分不同的IBV毒株。针对变异率较高的S1蛋白等设计引物，可以实现血清型或基因型的特异性扩增；而针对N、M等保守区域设计引物，则可以实现群特异性扩增。刘金朋等[17]根据IBV N基因序列设计引物，建立了RT-PCR方法。于申业等[18]根据IBV 793/B株S1基因序列设计引物，建立了检测IBV 793/B的RT-PCR方法。程晓霞等[19]根据IBV M基因设计引物，建立了检测IBV的RT-PCR方法。姚四新等[20]根据IBV ZZ2004 3a、3b及E基因序列设计引物，建立了检测IBV ZZ2004变异株的RT-PCR方法。高文倩等[21]根据IBV强毒株和弱毒疫苗株序列差异设计引物，建立了一种基于免疫磁珠富集IBV后，检测S1基因多变区的多重RT-PCR方法，可以快速鉴别IBV强毒株和弱毒疫苗株，为IBV检测提供了新的技术支持。

2.2 荧光定量RT-PCR

实时荧光定量RT-PCR与普通RT-PCR相比，特异性和灵敏度都更高，是一种IBV快速检测的新方法。王鹏等[22]、于新友等[23]、苗立中等[24]分别根据IBV N、M、E基因设计引物，建立了检测IBV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法。梁耀峰等[25]根据IBV N基因序列设计特异的H52株荧光定量RT-PCR检测引物和Taq Man-MGB探针，建立了快速检测IBV H52株检测方法。屈素洁等[26]在国内首次针对IBV N基因和NDV NP基因，设计引物和TaqMan探针，建立了同时检测IBV和NDV的双重荧光定量RT-PCR，实现了多种病原的同时检测。

2.3 环介导逆转录等温扩增技术（RT-LAMP）

RT-LAMP技术是在RT-PCR基础上建立的一种新型核酸检测方法，具有简便、快速高效、敏感性强等优点，适合基层业务部门及养殖场的检测。刘宇卓等[27]根据IBV M基因设计引物建立了RTLAMP方法，其检测极限比RT-PCR更高，具有良好的特异性和敏感性。马利[28]根据5a+5b基因序列设计引物，范瑾[29]根据M基因设计引物，鲜思美等[30]根据N基因设计引物，分别建立了检测IBV RT-LAMP方法。

2.4 核酸探针技术

核酸探针技术具有高度特异、敏感、快速、简便等优点。孟凡磊等[31]根据IBV N基因序列设计引物，成功制备出地高辛标记的IBV核酸探针，对IBV的最低检出量为10 pg。莫胜兰等[32]用地高辛标记IBV pol基因保守片段制作探针，克服了RT-PCR非特异性反应和探针Northern杂交的不稳定性。

2.5 基因芯片技术

该技术是近年来分子生物学与微电子学等多学科交叉融合而成的一项高新技术，具有高通量，并行性和结果判读客观、准确及信息化等特点。曹三杰等[33]首次成功制备了NDV-IBV-AIV-IBDV基因芯片。赵玉佳等[34]构建了联合检测NDV、IBV、ILTV的基因芯片。杨国淋等[35]则在此基础上，将不对称PCR和基因芯片结合，同时增加cy3标记引物浓度，从而提高了芯片探针与靶基因的杂交效率和灵敏度。基因芯片技术克服了常规生物学方法仅能对少数靶标基因检测的缺点，减少了结果判断的主观因素，能够同时对多种混合感染疾病进行诊断。

3 小结

由于IBV基因组核酸在复制过程中易发生突变和高频重组，因而该病毒血清型多，变异株不断出现，且不同血清型之间交叉保护力弱，常导致免疫失败，使得IB难以有效控制。临床上IB与新城疫、禽流感、传染性喉气管炎、传染性鼻气管炎等的症状类似，必须依靠实验室检测方法进行确诊。虽然IBV血清学、分子生物学检测方法的研究有了较大进展，但每种方法各有优缺点。在实际检测中，可以根据检测目的不同，结合实际条件，选择适宜的检测方法或将几种方法结合起来使用。相信随着实验室检测技术的不断研究与应用，尤其是分子生物学研究的更加深入，IBV检测技术将会得到不断发展和完善。参考文献：

[1] 陆苹，张斌，朱建国. RT-PCR检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立[J]. 上海交通大学学报（农业科学版），2003，21（s1）：10-13.

[2] 杜恩岐，刘胜旺，孔宪刚，等. 鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因在大肠杆菌中的表达及抗原性初步研究[J]. 病毒学报，2003，19 （4）：342-347.

[3] 秦卓明，赵继勋，陆友龙，等. 用气管环交叉中和试验鉴定IBV山东分离株的血清型[J]. 畜牧与兽医，2000，32 （3）：8-10.

[4] 付润饶. 检测鸡传染性支气管炎病毒抗体间接ELISA方法的研究[D]. 成都：四川农业大学，2014.

[5] 郑卫峰，闫芳，王盼，等. 鸡传染性支气管炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医，2015，42（6）：1383-1388.

[6] 李广兴，王新，潘龙，等. IBV HH06株N基因原核表达及间接ELISA方法的建立[J]. 东北农业大学学报，2014，45（5）：75-82.

[7] 孙罗美，易林，邹年莉，等. 鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原表位的串联表达及间接ELISA方法的建立[J]. 畜牧兽医学报，2012，43（11）：1780-1787.

[8] 苗立中，祖立闯，王艳，等. 鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立与应用[J]. 中国兽医学报，2017，37（3）：426-432.

[9] DING M D，YANG X，WANG H N，et al. Development of an ELISA based on a multifragment antigen of infectious bronchitis virus for antibodies detection[J]. Biotechnology letters，2015，37（12）：2453-2459.

[10] 阎芳，李宏全，邱剑阳. ABC-Dot-ELISA检测鸡传染性支气管炎病毒[J]. 中国兽医科技，2000，30（4）：21-23.

[11] 王林川，黄爱芳，游洪. Mab-ELISA对IBV毒株定性检测方法的建立与应用[J]. 华南农业大学学报，2001，22（1）：74-77.

[12] 季文彬. 双抗体夹心ELISA检测传染性支气管炎病毒方法的建立[D]. 扬州：扬州大学，2017.

[13] 白妍. 鸡传染性支气管炎病毒HH06株单克隆抗体制备及抗原捕捉ELISA方法建立[D]. 哈尔滨：东北农业大学，2016.

[14] 王泽霖，王新卫，刘守川，等. 银加强金标免疫技术及在传染性支气管炎病毒检测中的应用[J]. 河南农业大学学报，2005，39（2）：201-205.

[15] 苏磊. 鸡传染性支气管炎免疫胶体金诊断试纸研究[D].重庆：西南大学，2008.

当 C1＞2Fr1＋E0＋m 时， 是r0的增函数，当高昂的科技研发费用成为企业开展绿色化生产模式的最大负担时，金融机构的优惠利率能够吸引企业通过技术创新开展绿色化生产模式。当C1＜2Fr1＋E0＋m时，P∗1是r0的减函数，此时企业的科技研发投入与主营业务收入及政府补贴相比差距较大，金融机构优惠的贷款利率不是企业选择走绿色化生产模式的决定因素。

[16] 郑卫峰. IBV双抗体夹心ELISA检测方法的建立及免疫胶体金试纸条的研制[D]. 晋中：山西农业大学，2016.

[17] 刘金朋，商艳红，陈红英，等. 鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR快速检测方法的建立[J]. 中国农学通报，2011，27（3）：342-346.

[18] 于申业，刁有祥，杨杰华，等. 鸡传染性支气管炎病毒793/B RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 中国兽医学报，2007，27（4）：441-444.

[19] 程晓霞，王劭，朱小丽，等. 鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR检测方法的建立[J]. 中国农学通报，2009，25（5）：14-17.

[20] 姚四新，王宪文，赵淑秋，等. 鸡传染性支气管炎病毒变异株ZZ2004 RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 中国兽医杂志，2013，49（4）：15-17.

[21] 高文倩，韩潇潇，王红宁. 鸡传染性支气管炎病毒强毒株和弱毒疫苗株的免疫磁珠-多重RT-PCR鉴别方法的建立[J]. 中国家禽，2017，39（10）：14-17.

[22] 王鹏，高峰，王园，等. 鸡传染性支气管炎病毒Realtime RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 中国农学通报，2013，29（8）：45-49.

[24] 苗立中，祖立闯，王艳，等. 鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立与应用[J]. 中国兽医学报，2017，37（3）：426-432.

[25] 梁耀峰，郭霄峰，宋立，等. 鸡传染性支气管炎病毒H52株TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医，2012，39（4）：169-173.

[26] 屈素洁，施开创，邹联斌，等. 新城疫病毒和传染性支气管炎病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2014，36（11）：867-871.

[27] 刘宇卓，韩凯凯，李银，等. 鸡传染性支气管炎病毒RT-LAMP检测方法的建立[J]. 江苏农业学报，2013，29（4）：818-821.

[28] 马利. 禽呼肠孤病毒和传染性支气管炎病毒的环介导等温扩增检测方法的研究[D]. 泰安：山东农业大学，2012.

[29] 范瑾. 鸡传染性支气管炎病毒RT-LAMP检测方法的建立及S1蛋白T细胞表位的筛选[D]. 晋中：山西农业大学，2013.

[30] 鲜思美，杨钰，汪德生，等. RT-LAMP检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立及应用[J]. 中国兽医杂志，2014，50（8）：26-29.

[31] 孟凡磊，有祥，王辉，等. 鸡传染性支气管炎病毒地高辛标记探针检测方法的的建立和应用[J]. 福建农业学报，2007，22（1）：39-42.

[32] 莫胜兰，刘惠莉，陆承平. 核酸探针检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立及应用[J]. 中国兽医学报，2007，27（2）：168-171.

[33] 曹三杰，文心田，肖驰，等. 几种主要禽疫病诊断基因芯片的制备及初步应用[J]. 畜牧兽医学报，2006，37（4） ：356-360.

[34] 赵玉佳，黄宁，文翼平，等. 新城疫病毒传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒共检基因芯片的构建[J].中国兽医科学，2015，45（9）：952-958.

[35] 杨国淋，赵松，尹人杰，等. 结合不对称PCR技术构建鸡NDV-IBV-ILTV联合检测基因芯片[J]. 农业生物技术学报，2016，24（1）：142-150.