对动物检疫中检测试剂使用问题的探讨

李晓琳，吴绍强，景宏丽，王 勤，刘晓飞，仇松寅，林祥梅

（中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所，北京 100176）

进出境动物检疫工作直接关系到国门安全，而敏感、特异的检测试剂是确保检疫任务顺利完成的前提。因此对常用检测试剂进行对比，充分了解其各参数指标，以便在实际工作中加以选择应用就显得格外重要。

目前检测试剂的对比已广泛应用到多个领域，如Balmaseda等[1]对4种寨卡病毒ELISA检测试剂盒和2种RT-PCR检测试剂盒进行了比对，Felin等[2]对4种弓形虫抗体ELISA与凝集试验进行了比较，Floras等[3]对一种犬类降钙素原（Procalcitonin，PCT）（败血症的生物标志物）商品化试剂盒进行了验证，Palle-Reisch等[4]对两种商品化芥菜ELISA试剂盒和3种自主研发的实时PCR方法进行了比较。

本文通过近几年我国动物检疫常用试剂的比对，梳理了其在使用过程中遇到的问题，并在此基础上提出了相应的解决措施，以期为我国进出境动物检疫试剂的选用提供技术支撑。

1 存在的问题

1.1 检测靶标不同导致结果出现差异

随着市场需求的增多，同一种疫病的同一种检测方法在市场上会出现多个不同品牌的试剂。ELISA试剂盒因包被抗原不同，PCR方法因针对基因不同均可导致检测结果出现差异。同时不同国家或地区生产的试剂盒大部分更适用于本国或地区，当检测其他国家或地区的样品时，结果也会出现一定差异。

王勤等[5]利用“两步法”对4种市售猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV） 抗 体 ELISA检测试剂盒进行了比较，发现其中2种试剂盒为通用型试剂盒，即能够同时检测欧洲型和美洲型PRRSV，另外2种为美洲型试剂盒，仅能够检测美洲型病毒抗体，当样品中含有欧洲型病毒抗体时，则不能被检测出。

史茜等[6]针对非免疫无口蹄疫猪血清、免疫3次以上的健康猪血清、免疫感染和非免疫人工感染的猪血清共计4个群体的样本，比较了4个厂商的口蹄疫病毒非结构蛋白抗体ELISA试剂盒。结果显示，4种试剂盒针对不同群体的诊断敏感性为76.8%～94.4%，诊断特异性为97.7%～100%。

Lane等[7]对包拉米虫的10个混合样品，运用针对actin 1和18S rRNA的两种荧光PCR方法进行了检测，发现针对actin 1基因的方法未出现阳性结果，而针对18S rRNA基因的方法能成功检测出5个阳性样品。季新成等[8]利用来自澳大利亚的牛血清（41份）、新西兰的牛血清（40份）、乌拉圭的牛血清（30份）和我国新疆的牛血清（46份），对Svanova、IDEXX和VMRD生产的3种ELISA试剂盒进行了比较，发现检测结果因样品来源的不同而有所差异。

1.2 检测方法不同导致检测结果出现差异

为了对疫病进行更准确检测，针对同一种疫病往往使用多种检测技术，而不同检测方法常导致结果差异。副结核病常用的检测方法包括迟发型变态反应（Delayed type hypersensitivity，DTH）和ELISA法等。2013年，新疆出入境检验检疫局采用DTH和ELSIA法先后对两批共计2 106只澳大利亚进境种羊进行了副结核病检测：用DTH对第1批1 344只羊进行检测，检出阳性69只，而应用ELSIA方法检出阳性1只；应用DTH对第2批762只羊进行检测，检出阳性68只，而应用ELSIA方法检出阳性2只。这表明DHT和ELISA方法的检测结果差异较大。目前国际贸易中常用的布鲁氏菌病检测方法有虎红平板凝集（RBT）、血清凝集试验（试管法，SAT）、补体结合（CFT）和酶联免疫吸附试验（ELISA）。

王玉玲等[9]利用321份样本，对RBT、SAT、CFT、iELISA、cELISA和荧光偏振试验（FPA）进行了比对。将cELISA作为参考标准，发现RBT、SAT更适用于布鲁氏菌病的早期诊断；CFT的敏感性明显低于iELISA、FPA、cELISA，但特异性和阳性预测值都相对较高。

高 洪 霞[10]等 通 过 RBT、SAT、HVRI-cELISA、IDEXX-iELISA和Svanova-cELISA方法，对牛羊布鲁氏菌疫苗免疫后的血清抗体进行了检测，发现IDEXX-iELISA与其他方法的结果差异较大，HVRI-cELISA与Svanova-cELISA的符合率较高。

赵祥平等[11]利用3 998份乌拉圭进口奶牛，通过比较ELISA、AGID和PCR方法检测牛白血病的检出率和符合率发现：ELISA的检出率最高，PCR最低；AGID与ELISA的符合率为78%，而PCR与ELISA和AGID的符合率分别为43%和55%，符合性较差。

季新成[12]对新疆15个地区的635份牛血清，采用SYNBIOTICS公司的ELISA试剂盒进行了牛传染性鼻气管炎病毒血清抗体检测，对其中的35份又用病毒中和实验（VN）进行了检测，发现同为阳性的24份，同为阴性的7份，两者符合率为88.6%。

1.3 检测试剂性能不同导致检测结果出现差异

实际工作中，某些检测试剂的特异性不高，易与同种属的其他疫病发生非特异性反应，造成检测结果出现假阳性，影响检疫把关的准确性。施马伦贝格病是2011年夏季在德国首次发现的一种虫媒性病毒病，在欧洲的大部分国家均有发生[13]。因其病原与赤羽病病原均属于布尼亚病毒科正布尼亚病毒属辛波血清群，基因序列存在一定的同源性，在实际工作中，检测这两种疫病的试剂常无法将两者完全区分出来，存在一定的非特异性反应。

肖雷等[14]对1 150份样品进行了蓝舌病抗体检测，在AGID检测中，因蓝舌病病毒与EHDV、Ibaraki病毒有共同的群特异性抗原，导致在检测过程中出现非特异性沉淀反应，出现假阳性结果。

王玉玲等[15]用3 955份种牛血清样品，对PANAFTOSA实验室的口蹄疫3ABC非结构蛋白间接ELISA（简称间接ELISA）进行了评价，运用酶联免疫电转移印迹试验（Enzyme-linked immunotransfer blot，EITB）、iELISA、RT-PCR方法进行了验证，发现此试剂盒的假阳性率较高，特异性较差。

在实际工作中，某些检测试剂的敏感性低，易造成漏检现象发生，导致患病动物进入国内，对我国的疫病安全造成威胁。

肖妍等[16]通过微量血清中和试验，验证了690份澳大利亚纯种荷斯坦奶牛血清，对两种赤羽病ELISA试剂盒进行了比较，发现日本某公司生产的赤羽病ELISA试剂盒诊断敏感性仅为39.47%。

王玉玲等[17]利用34份背景清晰的牛血清样本，对4种市售副结核病ELISA试剂盒进行比对，发现仅1种试剂盒获得了满意的结果，其余3种试剂盒的检测结果均存在一定问题。

吴华伟[18]等利用57份标准血清，对5个国内厂家生产的猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）抗体检测试剂盒进行了测定，同时比较了试剂盒间的符合率，发现5种试剂盒的诊断敏感性差异较大，位于57.7%～100%之间，且各试剂盒间检测结果的符合率仅为63.2%，表明仅2个试剂盒适用于PCV2抗体检测。

2 解决措施

动物检疫常用试剂质量的好坏直接关系到检测结果是否准确可靠。目前，市售试剂盒的质量参差不齐，如何在纷繁复杂的市场中快速挑选出适用于检疫工作需求的检测试剂，建议采取如下措施：

2.1 建立标准化、规范化的质量评价体系

世界大部分国家和地区均建立了符合自己国情的动物检测试剂质量控制体系，并指定专门机构对试剂进行评价和准入。近年来，受原国家质量监督检验检疫总局动植物监管司委托，中国检验检疫科学研究院陆续开展了牛流行性腹泻/粘膜病等6种常用动物疫病检疫试剂质量评价工作，以分析敏感性、诊断敏感性、诊断特异性、批内和批间变异系数等作为试剂盒评价指标，以样品盘代表性、试验室检测资质等作为实验室评价指标，通过对试剂供应商、评价实验室开展“双招标”，确保了评价结果的科学、客观、公正。但由于此工作尚处于起步阶段，在今后的工作中应不断吸取经验教训，逐步建立起标准化和规范化的评价体系。

2.2 依据检测目的选择相应试剂，多种方法配套使用

疫病的检测方法虽然种类繁多，但没有一种方法适合所有的个体或群体流行病学调查，对个体进行筛查时所有的方法均存在一定局限性。在实际工作中，可以根据不同的检测目的，选取相应的检测试剂。如：当应用于疫病的筛查、流行病学调查等工作时，应选择诊断敏感性高的“广谱”检测试剂，提高检出率；针对临床发病病例、疑似疫病的确诊时，则应选择诊断特异性较高的检测试剂，确保检测结果的可靠性；将两者有机结合，如在一线口岸初筛工作中可首先选用诊断敏感性高的检测试剂，防止“漏检”，确保口岸安全，对可疑阳性样品再采用诊断特异性高的检测试剂进行复核验证，保障检测结果经得起历史检验。同时，可依据世界动物卫生组织（OIE）《陆生动物诊断试验和疫苗手册》中推荐的“金标准”，对样品的状态进行最终的确认，保证结果的准确可靠性。

2.3 加强自主研发，提高检测水平

当前工作中使用的试剂，往往因生产国家或地区的不同，导致同一样品的判定结果出现差异。一方面，试剂盒本身的质量存在差异；另一方面，由于指标优化等环节采用的是国外动物的血清等临床样品，因此临床样品的背景值与我国本土品种亦可能存在差异。应借助科研院所、产业化机构的力量，联合研发具有我国自主知识产权的检测试剂，防止检测试剂“水土不服”。与此同时，我国应加大对检测人员能力的培训，不断提升检测水平，最大限度的降低因人员操作造成的结果差异。

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[4] PALLE-REISCH M，HOCHEGGER R，ŠTUMR S，et al.Validation and comparison of two commercial ELISA kits and three in-house developed real-time PCR assays for the detection of potentially allergenic mustard in food[J].Food chemistry，2015，174：75-81.

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