基因修饰ADSCs移植对皮瓣保护作用的研究进展

吴玉伟 马志兵 魏韩笑 沈才齐 金培生

皮瓣由血液供应的皮肤及其附着的皮下组织所组成，皮瓣转移到受区，与受区创面重新建立血液循环的过程为皮瓣转移的全过程。皮瓣在形成与转移过程中，最重要的是保证皮瓣成活，然而在整形外科实践中却常常发生皮瓣血循环障碍，导致皮瓣成活不良，甚至发生坏死。ADSCs一般都有很强的自我更新能力和多向分化潜能，主要位于机体脂肪组织中的一种间充质干细胞（MSC），ADSCs是间充质干细胞中易于培养和可大量应用的种子细胞，其作为细胞治疗在组织修复和再生医学方面的研究日益受到关注。ADSCs具有机体来源广泛，取材方便，对供体损伤小的特点，而且在体外增殖和迁移能力较强，在特定条件下可分化形成多种终末细胞，经多次传代后仍可保持其遗传性状的稳定，而且能稳定表达转染的外源性基因，分泌多种血管生成因子[1]，ADSCs已经变成组织修复和再生医学炙手可热的种子细胞[2]。ADSCs在低糖、低氧和低谷氨酸等条件下通常仍能保持活性。ADSCs具有低免疫原性和免疫调节能力[3-4]，非自体移植时，机体可出现一定程度的免疫排斥，但这种较低免疫排斥不会完全抑制异种脂肪干细胞在体内分化成血管内皮细胞。近年研究表明，人ADSCs传代以后表面组织相容性抗原的表达减少，并且与异体基因外周血单核细胞共同培养时，不刺激产生混合淋巴细胞反应，同时体外环境下也不引起T细胞的细胞毒作用，抑制了免疫反应[5]。研究证实，ADSCs还具有造血支持作用以及可被腺病毒等高度转染等优点，可作为基因转移良好的靶细胞；ADSCs易于外源性基因导入，可作为基因治疗的目的基因载体细胞，不管是腺病毒载体、质粒载体还是逆转录病毒载体，均可携带目的基因转染ADSCs，并且在体内能够高效地表达，而不影响其干细胞特性。

1 基因修饰增强 ADSCs移植效率

基因修饰又称之为基因增补，是指使用生物化学方法修改DNA序列，在宿主细胞内导入目的基因片段，或者将基因组中特定基因片段删除，从而使宿主细胞基因型改变或原有基因型加强。单纯脂肪干细胞移植会受诸多影响因素而造成移植后早期细胞的减少，使得其作用减弱，而基因修饰为脂肪干细胞充分发挥作用提供了一个新的契机。基因修饰脂肪干细胞有多种方法如：质粒转导、逆转录病毒转染、腺病毒转染及腺相关病毒转染。对于自体干细胞归巢过程被认为分为三个步骤：动员、运行及定植，干细胞归巢到损伤部位的确切机制尚未明了，其中SDF-1/CXCR4轴被认为在干细胞归巢动员过程中起重要作用，有人发现抑制SDF-1降解、SDF-1预处理或者基因修饰增加SDF-1、CXCR4表达，均可促进归巢、增强干细胞疗效[6-8]，除此之外MCP-1/CCR、HGF/c-Met与干细胞迁移、黏附相关。目前研究在干细胞跨越内皮的迁移中，一些黏附分子如整合素、选择素等与干细胞的定植密切相关，如整合素在干细胞表面的减少可明显降低干细胞归巢。一些细胞因子和生长因子被视为干细胞归巢因子如 SDF-1、HGF、FGF-2、IGF-1、HMGB-1等促进ADSCs归巢，如IGF-1可通过SDF-1α发挥作用，过表达IGF-1可显著增加干细胞动员数量[9]，HMGB-1可促进干细胞动员和归巢[10]。可通过基因修饰与脂肪干细胞归巢相关分子促进ADSCs归巢阶段而提高移植效率。

2 基因修饰增强ADSCs旁分泌

研究显示ADSCs具有分泌功能，可分泌多种不同的细胞因子[11-12]，作用于组织、器官发育过程，可发挥促血管形成、造血支持、抗凋亡、调节或控制免疫、促细胞增生等作用。ADSCs不但具有分化成多种组织细胞的潜能，而且能够旁分泌细胞因子，改善局部微环境，动员机体干细胞参与组织修复[13]。

目前关于ADSCs移植保护皮瓣研究中ADSCs促血管形成是最重要的保护机制，Pu等[14]发现脂肪干细胞治疗及其分泌因子IL-6可有效增强I/R损伤后皮瓣恢复和血管生成，机制可能是ADSCs分泌的IL-6通过STAT3磷酸化，然后IL-6通过经典的信号通路刺激血管生成，增强皮瓣I/R损伤后的恢复。Han等[15]发现ADSCs辅助治疗可显著提高静脉缺血再灌注型皮瓣的成活率，其是通过降低炎症反应、抗氧化反应、保护血管而发挥重要作用。Reichenberger等[16]发现脂肪干细胞治疗能显著提高缺血后皮瓣存活率，而这种效应伴随着显著的血管生成反应和血液灌注改善。Hasdemir等[17]发现ADSCs注射到皮瓣的底部增加了辐射大鼠背部皮肤模型皮瓣的存活率，ADSCs具有提高放射后随意皮瓣血供的潜力，这种积极作用的机制可能是血管内皮细胞修复后的血管新生和血管扩张。值得注意的是，ADSCs在缺血、缺氧及炎性环境中更能促进其旁分泌作用而发挥其保护作用，近来Zubkova等[18]在实验中应用肿瘤坏死因子α（TNF-α）处理ADSCs，发现TNF-α可使ADSCs中促血管化因子（成纤维细胞生长因子2、VEGF、白细胞介素8、单核细胞趋化蛋白1、细胞间黏附分子1）mRNA表达增加，提示了炎性因子环境可促进ADSCs发挥促血管化作用。Yue等[19]研究证实低氧预适应增强了脂肪干细胞在体内的存活能力，脂肪干细胞联合移植缺氧术前预处理可有效促进缺血性皮瓣成活率，提高大鼠背部并行皮瓣模型血管新生。王白石等[20]发现预先向拟形成皮瓣组织注射ADSCs后，在一定程度上阻碍了皮瓣的成活，并没有发挥ADSCs促血管新生的作用，移植前对ADSCs进行炎性微环境预处理，预先活化ADSCs后其在促进移植组织成活过程中发挥更大的作用。

ADSCs分泌的细胞因子中与创面愈合、血管重建密切相关细胞因子有多种，如血管内皮细胞生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、基质衍生因子（SDF-1）、胰岛素样生长因子（IGF）、血小板源性生长因子（PDGF）等。随着转基因技术的发展，人们通过病毒/非病毒载体将治疗基因导入ADSCs，使得ADSCs分泌某些因子的能力大大增强，并利用干细胞迁移和归巢的特性，使携带有特殊治疗基因的细胞准确定位创伤部位，通过治疗基因在一段时间内的持续表达，合成并释放需要的生物活性分子，产生治疗作用，提高了治疗的靶向性和效率。

碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）作为一种多功能性生长因子，具有高效促进血管内皮细胞、血管平滑肌细胞与成纤维细胞的生长及新生毛细血管形成的作用[21-22]。研究发现，ADSCs-bFGF可刺激皮瓣的血管新生，提高皮瓣的存活率[23-24]，其可能机制是两者相互协同，即ADSCs促进bFGF表达，反过来bFGF促ADSCs生长，从而可显著提高皮瓣成活面积。刘丹等[25]同样发现，bFGF促进ADSCs增殖，具有协同作用，ADSCs-bFGF可高效地刺激大鼠背部自身对照带蒂皮瓣血管新生，保护皮瓣。研究表明bFGF与受体结合后，能促进血管内皮细胞分裂，诱导其分泌纤溶酶原激活物并刺激胶原酶活性，在血管化过程中，起到明显的促进毛细血管基底膜降解的作用，使得新生血管侵入并融合，形成毛细血管网[26]。

血管内皮细胞生长因子（VEGF）被认为是血管形成密切相关的最重要的细胞因子，可促进内皮系细胞的存活及血管新生的发生，可与肝素特异性地结合，在生理或病理状态下均能发挥强烈的促进血管新生的作用[27]。Xu等[28]发现在兔耳静脉淤血皮瓣中原位ADSCs移植，可减轻皮瓣淤血，提高静脉淤血皮瓣成活率，并且指出这种作用可能与ADSCs促VEGF分泌能力密切相关。雷永红等[29]发现人血管内皮细胞生长因子（VEGFl65）基因转染大鼠脂肪干细胞（rADSCs），ADSCs可作为载体细胞，将VEGF基因运送到达皮瓣远端，并通过分泌VEGF而提高皮瓣成活面积。Traktuev等[30]将脂肪干细胞悬液与内皮细胞混合，于小鼠皮肤缺损处皮下注射后发现皮肤损伤局部血运增加显著。

基质细胞衍生因子1（SDF-1）是一种小分子量的趋化因子蛋白，可以提高包括ADSCs、EPCs等多种干细胞的旁分泌、增殖以及迁移能力，将SDF-1α和VEGF注射到小鼠皮下，SDF-1α表现出与VEGF相当的促微血管形成的能力。同时，VEGF与SDF-1α之问还存在着相互作用，SDF-1α能诱导内皮细胞中VEGF的表达，而VEGF也能诱导SDF-1α的表达[31]。曹菁等[32]将人脂肪干细胞局部移植到随意型皮瓣后，可上调血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1的表达，促进皮瓣的血管新生。近期发现ADSCs可分化为内皮细胞或EPCs[33]，且能释放血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞因子（HGF）、趋化间质来源因子-1（SDF-1）等促进血管新生的细胞因子[34-35]。

肝细胞生长因子（HGF）是近年来发现的一种间质细胞衍生多效性因子，参与胚胎发育、血管新生、创伤愈合和器官再生等生物学过程，具有高效的促血管生长作用，能促进血管新生，有助于侧支循环的建立，除了作用于肝细胞外，近来的研究，HGF还可以作用于多种细胞，包括血管内皮细胞、骨髓红系造血前提细胞等，促进其有丝分裂、迁移以及形态的发生，可以对多细胞组织结构的形成、维持、重塑起到重要的血管营养作用，能提高细胞抗凋亡的能力[36-37]。吴一杰[38]将腺病毒介导的HGF基因转染后hADSCs，用于辅助人脂肪颗粒的移植，发现腺病毒介导的HGF基因转染hADSCs可在裸鼠体内高表达HGF，能显著促进移植脂肪内的血管新生作用，提高移植脂肪的存活率。

血小板源性生长因子（PDGF）在创伤愈合过程中可以诱导功能性血管形成，目前认为血小板源性生长因子主要作用于血管形成后期，可以刺激成纤维细胞和平滑肌细胞的迁移活动。

多效生长因子基因（Ptn）是一个原癌基因，该基因目前已证实其能促进血管形成，诱导细胞迁移及刺激神经突触生长[39]，Ptn基因能转染小鼠ADSCs并高表达PTN蛋白，为组织工程血管构建种子细胞选择提供了新思路，为缺血性病理损伤治疗提供新手段。

3 基因修饰增强ADSCs移植后存活

目前研究通过对凋亡信号通路相关因子如利用p-Akt、Bcl-2、HO-1等因子过表达均可提高脂肪干细胞在移植区域的存活。Bcl-2抗凋亡蛋白在细胞凋亡的调节中有着重要的作用，扮演着抑制细胞死亡的角色[40]。利用Bcl-2转染的间充质干细胞不仅能够提高移植后的存活率，也能够增加VEGF的表达。基因转导上调Bcl-2的表达能够延缓脂肪干细胞的凋亡、增加脂肪干细胞旁分泌及促进脂肪干细胞的生长[41]。

4 展望

不可否认近年来ADSCs移植治疗方式具有无可替代的优势，但如何促进ADSCs移植后的存活、迁移、归巢，如何增强ADSCs抗感染、抗凋亡、抗缺血能力，对ADSCs移植促进皮瓣成活的疗效具有十分重要的意义。多因素影响ADSCs归巢，多细胞分子及其受体参与该过程，对基因与信号分子的逐步研究可能是明确ADSCs归巢机制的新的路径，相信随着细胞分子生物学等学科的不断深入研究，随着对相关细胞分子及其受体的了解有助于对其进行基因修饰，从而更好地解决ADSCs移植中潜在问题，从而最大程度上充分发挥ADSCs修复作用。

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