血浆EBV DNA检测在鼻咽癌诊疗中的研究新进展*

李金高 林少俊 陈晓钟

鼻咽癌发病率具有明显的地域特色，其高发区主要分布在中国南方、东南亚和北非等国家和地区［1］。尽管其病因尚未完全清楚，一般认为鼻咽癌的发病与遗传、环境因素如饮食以及EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染有关［2］。研究表明，90%以上高发区鼻咽癌患者血浆EBV DNA阳性，并且其拷贝数与肿瘤分期和肿瘤体积显著相关，成功治疗后迅速下降［3］。因此，血浆EBV DNA是鼻咽癌重要的肿瘤标志物。

1 鼻咽癌血浆EBV DNA的主要来源

EBV是一种线性双链DNA病毒，长约172 kb。90%以上的成人均已感染过EBV，并以潜伏感染的形式持续存在于人类B淋巴细胞内［4］。因此从理论上而言，鼻咽癌患者血浆中的EBV DNA既可以来源于鼻咽癌细胞，亦可能来源于潜伏感染的B淋巴细胞。但越来越多的证据表明，鼻咽癌血浆中的EBV DNA主要是来自于鼻咽癌细胞的游离短DNA片段。第一，90%以上的初诊鼻咽癌患者血浆EBV DNA阳性，而健康成人阳性率约5%，说明正常成人B淋巴细胞释放 EBV DNA 是偶然事件［3，5］。第二，对相同患者PCR产物进行凝胶电泳和基因测序，证实鼻咽癌组织EBV基因型和外周血浆EBV DNA基因型相同［6］。第三，采用DNA酶切和超高速离心后定量法证实，血浆中绝大多数（87%）EBV DNA片段小于181 bp。超高速离心使大分子DNA沉淀后，再次检测EBV DNA阳性的同一份血浆，所有健康人血浆EBV DNA全部为阴性，但48%鼻咽癌患者仍为阳性［7-8］。说明鼻咽癌外周血EBV DNA是游离的小片段DNA而非完整病毒颗粒。第四，鼻咽癌患者治疗前血浆EBV DNA持续存在并且拷贝数与肿瘤分期呈正相关，成功治疗后快速下降至检测极限以下，而健康人血浆EBV DNA多为一过性升高［8］。

2 血浆EBV DNA在鼻咽癌筛查和诊断中的价值

由于血浆EBV DNA主要来自鼻咽癌细胞，因此检测患者血浆EBV DNA作为鼻咽癌辅助诊断手段得到了广泛的重视，Lo等［9］采用实时荧光定量PCR方法，将鼻咽癌患者血浆EBV DNA阳性率提高至96%，而健康对照组阳性率仅7%。综合临床研究结果［3］，血浆EBVDNA检测诊断鼻咽癌的敏感性为90%～96%，特异性为88%～100%。由于其高敏感性和特异性的优势，组织或血浆EBVDNA亦可用于判定颈部淋巴结转移癌的原发病灶。在AJCC鼻咽癌临床分期（第8版）中，若颈部淋巴结转移癌伴EBV DNA阳性，即使鼻咽部未发现肿瘤，亦定义为T0期鼻咽癌［10］。

随着调强放疗的广泛开展，鼻咽癌疗效有了较大的提高。采用单纯放疗，早期鼻咽癌的7年生存率约95%，而Ⅲ、Ⅳ期患者经放化疗综合治疗后7年生存率分别为85%、65%［11］，因此早期诊断不但可以提高鼻咽癌生存率，而且避免了联合治疗带来更大的急慢性不良反应。由于鼻咽癌早期症状不典型，且鼻咽腔位置隐蔽，临床检查较不方便，因此多数鼻咽癌诊断时已属晚期［11］。血浆EBV DNA是早期筛查鼻咽癌比较理想的标志物。

Wong等［12］收集了中国香港疗养院健康评估中心6个月1 475例血液标本，排除1例鼻咽癌和1例单核细胞增多症患者以及1例白色人种后，30例无症状的EBV DNA阳性人群中发现1例鼻咽癌。Ji等［13］对广东省四会市、中山市825例鼻咽癌高风险者（VCA/IgA和EBNA1/IgA阳性）行EBV DNA进一步检查。在38例第1年内诊断的鼻咽癌中，33例EBV DNA阳性，1年内诊断鼻咽癌的敏感性为86.8%，特异性为90%，阳性预测值为30%（33/110），阴性预测值为99.3%（696/701），而且33例鼻咽癌患者中22例为Ⅰ/Ⅱ期。最重要的两项研究来源于中国香港中文大学［5，8］，研究者对间隔约4周两份血浆EBV DNA均阳性者定义为检测阳性，并行进一步的鼻咽镜和MRI检查。在原理验证性研究中，1 318例年龄40～60岁健康志愿者首次检查EBV DNA阳性者69例（5.2%），其中20例（1.4%）EBV DNA持续阳性者中发现3例鼻咽癌；随后进行的20 174例志愿者筛查中，首次血浆EBV DNA阳性者1 112例（5.5%），2次检测均阳性者309例（1.5%），其中300例行鼻咽镜检查，275例行鼻咽镜和MRI检查，1年内共诊断鼻咽癌34例，而阴性者仅1例在1年内诊断为鼻咽癌，血浆EBV DNA用于筛查1年内鼻咽癌的敏感性和特异性分别为97.1%和98.6%，阳性预测值为11%，阴性预测值为99.995%。尽管缺乏前瞻性随机分组研究，但上述研究好于鼻咽癌高发区EBV血清抗体的筛查结果，也明显高于目前各种肿瘤标志物在肿瘤筛查中约3%的阳性预测值［14-15］，而且在筛查发现的34例鼻咽癌中24例（70.6%）为Ⅰ/Ⅱ期（2013年中国香港鼻咽癌登记数据中为20%）。经过中位24个月的随访，筛查患者中仅1例出现肿瘤进展，3年无进展生存率为97%（明显高于历史对照的70%）。因此，血浆EBV DNA检测用于鼻咽癌筛查可早期诊断鼻咽癌。

3 血浆EBV DNA在诊断鼻咽癌治疗后复发、转移中的价值

随着肿瘤的缩小和消失，鼻咽癌治疗后血浆EBV DNA迅速下降至检测极限以下［16-17］。研究表明，外科手术切除复发肿瘤后，鼻咽癌患者血浆EBV DNA的中位半衰期为139 min［16］，放疗后中位半衰期为3.8天［17］。因此，成功治疗后EBV DNA持续存在或再次升高往往提示肿瘤进展。Chan等［18］研究结果显示，放疗结束后血浆EBV DNA升高者肿瘤进展的相对危险度为11.9，阳性预测值和阴性预测值分别为87%和83%。Li等［19］对385例根治性治疗后鼻咽癌患者进行了52.8个月的随访，治疗后3个月检测血浆EBV DNA，57%EBV DNA阳性者和6.5%阴性者最终出现肿瘤进展，血浆EBV DNA诊断鼻咽癌治疗后肿瘤进展的敏感性、特异性和准确性分别为73.6%、87.2%和84.7%。Wang等［20］比较了血浆EBV DNA和PET/CT在判断鼻咽癌疾病进展中的价值，该研究中5例临床症状（骨4例、肺1例）和PET/CT均提示转移的患者，检测血浆EBV DNA阴性，无一例经病理和随访过程中出现肿瘤复发或转移；而36例血浆EBV DNA阳性患者均确诊肿瘤进展。

由于放疗后局部纤维化及血管闭塞等原因影响了EBV DNA释放进入血液循环，鼻咽癌放疗后局部、区域复发者血浆EBV DNA阳性率和拷贝数均明显低于远处转移者。研究发现，复发者血浆EBV DNA阳性率仅分别为56.4%和65%，而远处转移者分别为94%和96%［19，21］。Hong等［21］研究表明，从治疗结束至诊断局部或区域复发的中位时间为320天，而从治疗结束至血浆EBV DNA阳性的时间为338天，两者无显著性差异。但在转移的患者中，从治疗结束至血浆EBV DNA阳性和诊断远处转移的时间分别为190天和295天，说明血浆EBV DNA检测可较临床或影像学检查早3.5～6个月，提示或发现肿瘤转移［6，21］。

综上所述，血浆EBV DNA是提示鼻咽癌根治性治疗后肿瘤进展的敏感标志物。远处转移患者血浆EBV DNA阳性率和拷贝数均高于局部区域复发者［19-20］，因此治疗后血浆EBV DNA持续阳性或再次升高提示应更关注远处转移。目前，检测EBV DNA难以完全鉴别局部区域复发或远处转移，亦不能提示转移部位，需要进行详细的临床和影像学检查才能确诊。对全面检查未发现肿瘤进展的患者仍需要更积极的密切随访。

4 血浆EBV DNA在鼻咽癌预后判断中的意义

Lo等［22］研究显示，治疗后1年内肿瘤复发或转移者，其治疗前血浆EBV DNA拷贝数显著高于肿瘤控制者，拷贝数每增加10倍其疾病相关死亡率上升1.6倍。有研究认为，治疗前血浆EBV DNA较TNM分期更能反映患者的预后，如以4 000 copies/mL为界值，血浆EBV DNA高、低者5年无远处转移生存率相差10%［23］，N0～1期高EBV DNA拷贝数者与N2～3期拷贝数低者初诊远处转移率相似［24］，Ⅰ/Ⅱ期患者血浆EBV DNA高者的总生存率与Ⅲ期相似，而血浆EBV DNA低者其预后与Ⅰ期者相似［25］；以1 500 copies/mL为阈值，血浆EBV DNA是总生存率、无进展生存率、无远处转移生存率的独立预后因素；EBV DNA小于1 500 copies/mLⅣ期患者与大于1 500 copies/mL的Ⅲ期患者预后相似［26］。Lu等［27］认为，治疗前肿瘤体积和血浆EBV DNA水平均是鼻咽癌肿瘤控制和生存的独立预后因素，但血浆EBV DNA的预后意义大于肿瘤体积，体积较大和EBV DNA拷贝数较低（＜6 800 copies/mL）患者预后好于小体积高拷贝数患者。荟萃分析表明［28-29］，采用不同的界值，治疗前较高的血浆EBV DNA对总生存率、无远处转移生存率和无局部区域复发生存率的相对风险分别为2.78～2.81、3.26～3.89、2.02～2.07。

血浆EBV DNA检测可用于早期判断鼻咽癌对治疗的反应。Liu等［30］研究认为，新辅助化疗2个周期后血浆EBV DNA水平和肿瘤对新辅助化疗的反应是患者无进展生存率的独立预后因素，而只有新辅助化疗后血浆EBV DNA是无远处转移生存率的独立预后因素。Leung等［31］研究认为，放疗4周后血浆EBV DNA阳性是无远处转移生存率（相对危险度12）、无进展生存率（相对危险度4）和总生存率（相对危险度3.29）的危险因素，74%治疗失败患者与治疗中的血浆EBV DNA阳性相关。治疗过程中血浆EBV DNA阳性率可能反映了血浆EBV DNA的半衰期：半衰期短、治疗过程中EBV DNA快速转阴表明肿瘤对当前治疗有较好的反应，是预后良好的判断指标［29］。

根治性治疗后血浆中是否持续存在EBV DNA同样是重要的预后因素。如以4 000 copies/mL和500 copies/mL作为治疗前、后血浆EBV DNA拷贝数高低的阈值，Chan等［18］研究发现，治疗后血浆EBV DNA拷贝数是总生存率和无进展生存率最重要的预后因素，其预后意义超过治疗前血浆EBV DNA拷贝数和临床分期；淋巴结分期和治疗后血浆EBV DNA水平一同构成了远处转移的预后因素。多数研究认为，根治性治疗后只要血浆中出现可检出的EBV DNA，说明存在肿瘤残留或远处转移，是总生存和无进展生存的预后不良因素［32-34］。综合文献报道结果［28-29］，治疗后血浆EBV DNA阳性者对总生存率、无远处转移生存率、无局部区域复发生存率的风险比分别为4.26～5.43、7.54～8.19、7.51～7.63。

从目前的研究来看，检测治疗前、治疗中和治疗后的血浆EBV DNA均有助于判断鼻咽癌的预后。治疗前血浆EBV DNA水平可能部分补充了目前影像学检查对肿瘤负荷判断的不足，因此在制定治疗计划时是否应综合考虑分期和血浆EBV DNA拷贝数的结果；治疗过程中EBV DNA变化和血浆半衰期则反映了肿瘤对当前治疗的敏感性，半衰期长、治疗一定时间后血浆EBV DNA仍阳性甚至保持在较高水平是否需要及时改变治疗策略以便达到更好效果；而治疗后EBV DNA阳性则说明存在肿瘤残留或远处转移，是否需要进一步巩固治疗等问题，需要进行前瞻性研究加以证实。

5 血浆EBV DNA引导下的鼻咽癌治疗

同期放化疗是局部晚期鼻咽癌最主要的治疗方式，而新辅助化疗和辅助化疗的使用存在一定的争议。导致争议的原因之一是单纯依赖肿瘤分期从而存在患者选择性偏差所致。由于血浆EBV DNA具有预后意义，综合考虑肿瘤分期和血浆EBV DNA可能有助于弥补单纯根据肿瘤分期制定治疗策略的偏差。Du等［35］根据治疗前血浆EBV DNA、N分期等将881例局部区域晚期鼻咽癌分为低危组和高位组，高危组患者接受新辅助化疗可以显著提高无进展和无远处转移生存率，与低危组患者比较，两者无显著性差异。其他研究也证实，并非所有的局部晚期鼻咽癌均能从新辅助化疗中获益。Peng等［36］研究表明，治疗前血浆EBV DNA＜1 500 copies/mL的局部晚期鼻咽癌是否接受新辅助化疗具有相似的无远处转移生存率、无局部区域复发生存率和总生存率；Guo等［37］认为，只有非常高危的患者（N2～3期和EBV DNA＞4 000 copies/mL）才能从新辅助化疗中获益。

即使临床或影像学检查阴性，放疗后血浆EBV DNA阳性往往提示鼻咽癌残留或可能存在亚临床转移，能否对血浆EBV DNA阳性者进行早期干预，达到提高疗效的目的是值得研究的方向之一。Twu等［38］纳入86例治疗结束后血浆EBV DNA阳性的鼻咽癌患者，其中33例接受1年口服替加氟化疗，55例未行辅助化疗，中位随访70个月后，接受和未接受辅助化疗者出现肿瘤进展分别是45.5%和71.2%，5年总生存率分别为71.6%和28.7%，差异的主要原因是远处转移，两者局部或区域肿瘤控制率无显著性差异，提示辅助化疗可以减少治疗结束后血浆EBV DNA阳性患者的远处转移率从而提高总生存率。但最终结论需待NRG肿瘤组织的前瞻性、国际多中心Ⅱ/Ⅲ期临床研究结果（NRG-HN001）。该研究包括平行的2个前瞻性随机分组研究，Ⅲ期非劣效性研究比较鼻咽癌同期放化疗后血浆EBV DNA阴性者单纯随访和常规PF方案的疗效；Ⅱ期研究探讨治疗后血浆EBV DNA阳性者紫杉醇联合吉西他滨是否优于常规PF方案（NCT02135042）。

需要特别注意的是，目前有关鼻咽癌血浆EBV DNA的研究主要来自于鼻咽癌高发区，因此是否能推广到非高发区需要相应的研究证实；回顾性研究较多，前瞻性研究较少，随机分组的研究更少，因此尚缺乏高级别的临床证据；另外目前各实验室无论是检测设备、DNA提取、检测的DNA片段、质控、检测极限值等均缺乏统一的标准，因此各单位报道的结果难以直接进行比较。为此，美国国家卫生研究院（NCI）成立了专门的组织，成员包括美国、中国上海、中国台湾、中国香港、新加坡等国家和地区的专家，用以协调各地的血浆EBV DNA检测，以便制定标准化的检测方法［39］。

综上所述，血浆EBV DNA检测在鼻咽癌诊断和筛查、复发转移的诊断、预后判断以及个体化治疗等均具有潜在的意义。标准化检测方法的确立以及在此基础上开展临床前瞻性研究，将进一步明确血浆EBV DNA检测在鼻咽癌诊疗中的作用。

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