牛传染性鼻气管炎病毒实验室检测方法研究进展

庄金秋，梅建国，刘吉山，张 颖，莫 玲，姚春阳

（山东省滨州畜牧兽医研究院，滨州 256600）

牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine rhinotracheitis，IBR）又称坏死性鼻炎（Necrotis rhinitis，NR）或红鼻病（Red nose disease，RND），是由疱疹病毒科的牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病，临床上以高热、呼吸困难、鼻炎、鼻窦炎为主要特征。以20～60日龄的犊牛最为易感，6周龄以下的犊牛病死率可达85%～100%。IBRV又称为牛疱疹病毒 1型（Bovine herpesvirustype 1，BHV-1），具有典型的泛嗜性，能侵袭牛的多种组织和器官，引起鼻气管炎、脓疱性外阴-阴道炎、龟头-包皮炎、母牛流产和死胎、乳房炎、子宫内膜炎、肠炎、结膜炎和犊牛脑膜脑炎等多种疾病。IBRV侵入牛体后，以潜伏感染和持续性感染为特征，影响牛的生产力，给养牛业造成巨大的经济损失。

牛传染性鼻气管炎首次发现于上世纪50年代，在美国罗拉多州发现了以传染性鼻气管炎症状为特征的疾病，随后在洛杉矶和加利福尼亚州等地也相继出现，我国于1980年首次从新西兰进口奶牛中检测到病毒并分离出来。该病呈现世界性流行，被世界动物卫生组织（OIE）列为B类传染病，也是我国进出境动物和国际动物贸易中规定的重点检疫对象。本病目前尚无特效治疗药物，疫苗接种和扑杀是当前主要的防控措施，因此建立快速准确的检测方法，显得尤为重要。本文综述了IBRV的最新实验室检测方法研究进展，以期为IBR的诊断和防控提供参考。

1 病毒分离与鉴定

1.1 病毒的分离鉴定

IBRV能在多种原代或传代细胞中生长，如牛肾、胚胎皮肤、肾上腺、甲状腺、睾丸、肺、鼻甲或气管等均可生长，目前较为普遍应用的是牛肾传代细胞（MDBK）和牛气管传代细胞（BTC）。临床上，根据病牛不同的临床症状，采集的样品也不同：呼吸道型病例主要是采集患病初期病牛的鼻液或眼分泌物；母牛生殖道型病例采集外阴部黏膜和阴道分泌物，公牛生殖道型病例采集精液和包皮的生理盐水冲洗物；流产型病例可收集胎儿胸腔液或肺等实质脏器；脑膜脑炎型病例可采集脑组织。将根据不同临床症状收集的病料接种到MDBK细胞上培养3～5 d，观察细胞病变（CPE）。病料感染MDBK后如果产生细胞圆缩，呈葡萄样聚集，形成空洞，多核巨细胞等典型CPE，可初步诊断为IBRV感染，可进行中和试验、免疫荧光试验，或电镜观察病毒粒子进一步鉴定。李琳琳等［1］、王延涛［2］利用 MDBK 细胞分别从牛鼻咽分泌物和阴道分泌物中分离并鉴定出一株IBRV。MDBK病毒分离方法可靠，但缺点是费时、费力，且分离过程比较复杂，因此在临床中不便推广应用。

1.2 包涵体检查

将IBRV接到MDBK等易感细胞上，待细胞出现CP E后用Lendrum染色法染色，镜下观察可见细胞核被染成蓝色，胶原染成黄色，特征性核内包涵体被染成红色。也可采取病牛病变部位的上皮组织（鼻腔、眼结膜、角膜等组织）制成切片后染色、镜检。

2 血清学检测方法

2.1 病毒中和试验（VN）

中和试验是最经典、最标准的检测血清抗体的方法，是OIE指定方法之一。王延涛［2］将抗IBRV阳性血清中和分离到的毒株，进行了进一步的PCR检测，结果证实，标准毒株与分离毒株的扩增产物大小一致。病毒中和试验的缺点是耗资费力、操作繁琐、试验周期长、对操作人员的操作熟练程度要求较高、不适用于大批量的样本检测。

2.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA法具有敏感、快速、操作简便等优点，已被广泛应用于IBRV的检测，也为OIE指定方法之一。ELISA方法有多种，以间接ELISA最为常用。IBRV具有良好免疫原性的蛋白主要有gB、gC、gD、gE和gG，这些蛋白已先后被作为IBRV检测的靶蛋白，用于建立ELISA方法，并显示出较好的检测效果。朱元茂等［3］、杨娟［4］先后建立了IBRV全病毒作为检测抗原的间接ELISA方法。李兆利等［5］、李伟等［6］、吴春涛等［7］、曹翀等［8］先后建立了检测IBRV gB抗体的间接ELISA方法。祖立闯等［9］、董华兴等［10］、陈婷［11］、宋玲玲［12］、齐晓雪［13］等先后建立了检测IBRV gD抗体的间接ELISA方法。王海燕等［14］、Bertolotti等［15］先后建立了检测IBRV gE抗体的间接ELISA方法。颜邦芬［16］建立了检测IBRV gG抗体的间接ELISA方法。石建平［17］建立了检测gB3抗体的阻断ELISA。王冰［18］建立了检测IBRVgG抗体的竞争ELISA方法。马辉等［19］、周跃辉［20］分别制备了 gC 和 gD 的特异性单克隆抗体并建立了双抗体夹心ELISA方法。Casarin等［21］建立了一个基于抗生物素蛋白-核酸的组装体（ANANAS）技术的新型ELISA方法，这是一种基于纳米颗粒级别的胶状多聚抗生物素蛋白新型的用于免疫诊断学的信号放大平台，可广泛应用于疾病诊断程序中。

2.3 间接血凝试验（IHA）

IHA是一种简单快速的检测血清抗体的方法。陈天祥等［22］、杨春明［23］先后建立了 IBRV 的 IHA 方法，并取得较好效果。但IHA方法受诸多客观因素的限制，容易出现假阳性结果。

2.4 琼脂扩散试验（AGP）

AGP即可检测抗体，也可检测抗原。该方法操作简单，成本较低，但由于其敏感性较低，只有当感染牛抗体呈现很高滴度才能检出，不适用于疾病的根除，应用价值受到限制。

2.5 间接免疫荧光（IFA）

IFA主要用于检测抗原。通常将抗牛免疫球蛋白第二抗体与异硫氰荧光素连接成荧光抗体，加到接有IBRV的细胞培养物中，置荧光显微镜下观察结果。该法费时费力，其敏感性也低于病毒分离。

2.6 胶体金技术

胶体金技术简单快速，适合大量样品的临床检测。石建平［17］用胶体金标记IBRV单抗检测IBRV，其研制试纸条与PCR的阴性符合率99.17%。王武军等［24］建立了斑点免疫金渗滤法（DIGFA）检测IBRV抗体，仅需5 min即可判断结果。

3 分子生物学检测方法

3.1 RT-PCR

RT-PCR方法具有敏感、特异、快速等特点，已被广泛用于检测人工感染或自然感染牛精液、血清或组织样品中的 IBRV。张桂红等［25］、林梅等［26］先后根据 IBRV TK基因序列设计引物，建立了可鉴别IBRV TK基因缺失株与野毒株的 PCR 方法。徐淑菲等［27］、杨少华等［28］、王嵩等［29］、王吉等［30］先后根据 IBRV gB 基因序列设计引物建立了PCR方法。邓碧华等［31］根据IBRV的gB和gE基因序列设计2对特异性引物，建立了套式PCR方法，能够检测IBRV及有效区分IBRV野毒株和gE基因缺失疫苗株。王冰等［32］根据IBRV gD基因序列设计引物建立了PCR方法。王冰等［33］根据gG基因设计引物，建立了一种既能快速检测IBRV，又能区分同属病毒牛疱疹病毒5型（BHV-5）和伪狂犬病病毒（PRV）的PCR方法，在牛疱疹病毒感染诊断和标记疫苗免疫后的鉴别诊断方面具有良好的应用前景。范晴等［34］建立了同时检测牛支原体（MB）、牛病毒性腹泻-粘膜病病毒（BVDV）和IBRV的三重二温式PCR方法，可鉴别诊断3种疾病，具有较高的临床应用价值。

3.2 荧光定量RT-PCR

实时荧光定量RT-PCR比普通RT-PCR具有更高的敏感性和特异性，为IBRV感染的快速检测提供了一种新的方法。唐泰山等［35］根据IBRV的gB和gE基因序列，分别设计2对引物及其相应的TaqMan探针，建立了检测IBRV和区分gE基因缺失疫苗株及野毒株的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法。孙志明等［36］根据IBRV gE基因保守序列设计引物，建立了IBRV gE基因的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法，为鉴别IBRV野毒株和gE基因缺失疫苗株的感染提供了技术手段。蒋珊珊等［37］、徐娜等［38］分别根据 IBRV gB 和 gE设计2对引物及相应的TaqMan探针，建立了TaqMan荧光定量RT-PCR方法。用以检测IBRV及鉴别gE基因缺失疫苗株和野毒株。乔波等［39］、王海军等［40］根据IBRV gB基因保守区域设计特异性引物和探针，建立了IBRV的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，适用于临床疑似样品的快速定量检测。张喜喜等［41］根据IBRV gB基因序列设计引物及相应探针，分别建立了TaqMan探针与SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法，经对2种方法的敏感性等综合比较，发现2种检测方法无显著差异。

3.3 环介导逆转录等温扩增技术（RT-LAMP）

RT-LAMP技术是建立在RT-PCR基础上的一种新型核酸检测方法，具有简便、快速高效、敏感性强等优点，适合基层业务部门及养殖场的检测，为IBRV感染的快速检测提供了新方法。冯蒙［42］针对IBRV gB基因设计LAMP引物，建立了可用于检测IBRV的RTLAMP方法，与套式RT-PCR法对样品的检测结果的总符合率92.4%。皇甫和平等［43］建立了IBRV gE基因的RT-LAMP检测方法，对临床采集的50份奶牛鼻腔拭子DNA进行了检测，可用于IBRV分离株的鉴定以及临床样品的快速检测。郭利等［44］建立了IBRV gE基因的RT-LAMP技术。每微升反应体系中可检测到2.23×103拷贝的病毒基因含量。郭利等［45］应用金纳米颗粒与PCR结合建立了纳米PCR（nano-PCR）新型检测方法和LAMP可视化检测方法，并与普通PCR方法进行对比研究。结果显示，nano-PCR方法敏感性是普通PCR的100倍；LAMP样品检测用时最短，50 min即可得到检测结果。nano-PCR敏感性和特异性更适合于临床样品的检测，可与LAMP配合使用，对IBRV的筛查和预防提供技术支撑。

3.4 核酸探针技术

核酸探针技术具有高度特异、敏感、快速等优点，已被广泛应用于病毒感染的检测。吴时友等［46］用32P标记制备的探针可检出10 pg的IBRVDNA，能明显区分IBRV感染细胞和未感染的正常细胞。随后他用生物素代替32P制备的探针也取得了较好结果，能检测牛精液中IBRV DNA。

3.5 基因芯片技术

基因芯片技术检测疾病具有高通量、并行性和结果判读客观、准确和信息化等特点。季新成［47］将标有CY3的PCR产物与芯片上包被的寡核苷酸探针杂交，对IBRV质粒的检测灵敏度达到103拷贝/反应，而他又建立了IBRV的悬浮液态芯片检测技术，对IBRV的灵敏度为103拷贝/反应，具有较好的可重复性和特异性。陈圣军等［48］根据 IBRV gB 基因和赤羽病病毒（AKAV）S基因序列设计合成了2对特异引物和探针，建立了同时检测这2种病毒的基因芯片检测方法，从而实现了进行1次试验即可对IBRV和AKAV两种病毒达到快速准确检测的目的。

4 小结

近年来，我国养牛业正向集约化、规模化迅速发展，国内外活畜和遗传物质贸易日益频繁，这给IBR的流行与传播创造了良好条件。现有资料表明，本病在我国已呈现高度蔓延趋势，养牛业已遭受巨大损失。目前我国防制IBR还处在监测、扑杀、隔离的阶段，还没有配套的疫苗免疫及根除计划，因此加强病原检测技术和方法的研究对预防和控制该病具有非常重要的意义。综上所述，虽然IBRV的检测方法多种多样，技术在不断的革新和完善，但是每种方法均具有各自的优缺点和实用性，在实际中应根据具体情况选择适宜的方法。相信随着分子生物学技术的不断发展，IBRV的检测会向着更加敏感、特异、快速、简便、高效的方向发展，并在IBR的控制与净化中发挥重要作用，从而达到根除的目的。