内复制及其在肿瘤发生发展中的作用*

真核生物通常通过有丝分裂增加体细胞数量，经历G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）和M期（分裂期）这一细胞周期，每完成一次分裂得到与母细胞遗传物质一致的两个子代细胞。内复制细胞周期仅包含G期和S期，细胞并不发生分裂。其主要有两种形式：1）S期和G期交替进行，但染色体和胞质不分离，称为核内循环，可产生体积增大的单核细胞；2）虽然染色体分离，但是母细胞并未完成分裂，称为核内有丝分裂，可产生多核细胞［1-2］。无论通过何种形式，每一次内复制均使细胞内DNA含量增加一倍，形成多倍体巨细胞。从真菌到人类，各种有机体的正常发育和器官形成过程中内复制作用不可或缺［3-4］。在哺乳动物胚胎滋养层巨细胞、心肌细胞、肝细胞、血管平滑肌细胞、角化上皮细胞、肾原始足细胞中也有内复制现象和多倍体细胞的存在［5］。在创伤愈合和组织修复过程中，细胞可通过内复制驱动有丝分裂后细胞的生长进行代偿以维持组织稳态。临床上已经在癌组织中观察到内复制现象和多倍体细胞。由内复制形成的多倍体细胞常存在于高级别肿瘤以及放、化疗或靶向治疗后的肿瘤组织中，如在胃癌中内复制诱导的多倍体细胞在癌组织中约占11%，而肝细胞肝癌中这一比例达到54%［6］。由于多倍体细胞不具备有丝分裂的能力，以往认为这些细胞在肿瘤的演进过程中所起的作用微乎其微，然而越来越多的证据表明内复制以及其产生的多倍体细胞对于肿瘤的发生、演进和复发的重要性，且内复制过程中的DNA过度复制会造成基因组不稳定和非整倍体的产生，这些均为肿瘤发展的特征性变化，也使得内复制现象成为肿瘤学研究领域的又一热点。

1 内复制的生理作用

1.1 组织、器官的发育

内复制是许多有机体程序化生长的一部分。黑腹果蝇的多种幼虫期和成虫期组织均经历了多倍体化。果蝇幼虫唾液腺细胞通过内复制产生多倍体巨细胞，以确保分泌和储存足够的消化酶和胶质。果蝇后肠细胞中通过内复制形成的多倍体巨细胞对后肠维持水和离子平衡的功能有重要作用。在黑腹果蝇幼虫期脑的发育过程中，构成血脑屏障的神经末梢胶质细胞会逐渐发生多倍体化，若抑制内复制，其生长速度减缓且血脑屏障功能受损［7］。人类受精卵受精后继续分裂形成卵裂球，在卵裂球的不断生长过程中通过内复制产生了高比例的单核或者多核的多倍体细胞，形成未来的合体滋养层细胞，在母体血供和胚胎之间起屏障作用［8］。合体滋养层细胞也参与胚胎植入过程。值得注意的是，该过程与肿瘤的浸润过程较相似［9］。巨核系祖细胞经内复制形成8～32倍体后，其胞质才开始分化，随后开始产生血小板［10］。

1.2 创伤愈合和组织修复

有研究发现内复制在创伤愈合和组织修复中也非常重要。当组织发生损伤，部分细胞死亡后，死亡细胞周围的剩余细胞需要通过加速分裂增殖或使细胞体积增大进行代偿以维持组织和器官的形态和功能。由于内复制可以驱动有丝分裂后细胞的生长，所以细胞的代偿性肥大过程中常有内复制现象发生。在果蝇卵泡上皮组织中局部细胞丢失后，可以观察到代偿性肥大的细胞填补了缺损［11］。这种经内复制产生的代偿性肥大细胞不仅体积更大，DNA含量比之前增加了两倍以上。在黑腹果蝇成虫表皮细胞的研究中也发现，当组织被刺伤时，剩余细胞经可通过内复制或者细胞融合形成多倍体细胞［12］。果蝇的肠上皮在损伤修复或压力应对状态下，肠干细胞向肠上皮细胞分化过程中也要经历内复制，使DNA含量和细胞体积显著增加［13］。人类心肌细胞也会通过代偿性肥大以应对心功能需求的增加。肝损伤或部分肝切除后的肝再生过程中，大多数肝细胞进入S期，仅一部分细胞发生细胞分裂，其他细胞则发生内复制。当敲除肝细胞中有丝分裂必需的细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）和分离酶基因后，肝脏中多倍体细胞数增加，肝脏仍具有再生潜能。当在多倍化所必需的E2F7和E2F8基因缺失后，肝脏也仍具有再生潜能［14］，但这种情况下二倍体细胞数量显著增加，学者们认为是有丝分裂弥补了内复制的缺失，且这种内复制代偿性肥大和有丝分裂增生之间的平衡取决于损伤类型。当DNA受损时，肝细胞优先选择内复制来抵抗致死效应［15］。在应激状态下，心肌细胞和植物细胞也优选通过内复制来抵抗损伤。

2 内复制发生的分子机制

虽然有丝分裂和内复制经历不同的细胞周期，但其均依赖于G1周期蛋白的脉冲，有许多相同的调控蛋白。细胞进入内复制需要绕过有丝分裂的中心过程即染色体/胞质分裂，需要下调驱动G2期至M期的细胞周期蛋白依赖性激酶（M-CDK）的表达，同时活化驱动G1期至S期的细胞周期蛋白依赖性激酶（S-CDK），使细胞跳过M期进入S期，另外还需要后续的S-CDK的周期性灭活，以确保细胞再进入G期。在包括酵母在内的多种类型细胞中均发现抑制M-CDK的活性可使细胞进入内复制周期［16］，而在对黑腹果蝇进行的实验中发现S-CDK激活剂cyclin E的持续表达可以阻止内复制发生［17］。

在果蝇脂肪和唾液腺组织中，InR/Pi3K/TOR通路活化可促进细胞内复制［5］。在果蝇卵子发生过程中，Notch信号在细胞由有丝分裂向内复制转变过程中起关键作用。当生殖干细胞在胚芽中产生成核细胞后，其通过有丝分裂增殖产生一层包围生殖细胞的卵泡细胞［18］。生殖系细胞产生Delta配体与卵泡细胞上的Notch受体结合，导致Notch受体的蛋白水解，释放出Notch的细胞内结构域（NICD）。在细胞核内，NICD与转录因子SU（H）共同作用，诱导下游基因表达［19］。其中就包含能够诱导从有丝分裂周期转入内复制细胞周期的Fizzy结合基因［20-21］。在对果蝇唾液腺发育的研究中发现，E2F1的振荡转录对于内复制起着关键作用：在G期时E2F1的聚积可激活细胞周期蛋白依赖性激酶CycE/Cdk2启动S期，而后泛素连接酶CRL4 CDT2激活并介导E2F1的降解，抑制CycE/Cdk2的表达，从而允许在DNA形成预复制复合物，为新一轮内复制做准备。胰岛素和胰岛素样生长因子受体信号通路参与果蝇内复制使细胞发生代偿性肥大填补卵泡上皮缺损，而果蝇成虫表皮细胞通过Hippo信号通路的失活，JNK通路的活化诱导创伤愈合过程中的内复制和细胞多倍体化［12，22］。EGFR/RAS/MAPK通路也参与在果蝇肠上皮再生的内复制过程［13］。这些研究表明在不同类型的细胞中，内复制发生和调控的具体分子机制可能不尽相同，仍需深入研究。

3 内复制在肿瘤发生发展中的作用

3.1 基因不稳定

基因组的稳定扩增对有机体的生长和稳定必不可少，而内复制易导致基因的不稳定。在内复制过程中常可以观察到染色体畸变，后期桥接和染色体脱扣等基因不稳定的现象［23］。随着不稳定基因的逐渐积累，可能导致肿瘤发生。人类很多肿瘤类型中均存在多倍体瘤巨细胞，且其与患者不良预后密切相关。在内复制细胞中，由于所有基因完成复制前S期即停止，可造成臂间异染色质的复制不足，经过几轮内复制后，诱发DNA的损伤应答反应，但内复制细胞中由于促凋亡基因的下调和p53活化反应被抑制，细胞能够逃避凋亡而得以存活［24］。另外，因为大多数化疗药物均通过诱导细胞周期检测点依赖的凋亡而发挥作用，经过抑制有丝分裂的抗癌药物治疗后，尽管大部分细胞会因细胞周期停止而死亡，但一小部分细胞会由于抗癌治疗产生的压力应激状态进入内复制周期形成多倍体细胞被保存下来，在周围条件适宜时再发生去多倍体化以恢复有丝分裂，引起肿瘤复发，这在结肠癌中已有一些支持的实验研究［22，25］。

3.2 去多倍体化

自然发育过程中多倍体细胞的内复制现象常被认为是不可逆的。然而有些研究发现当减数分裂相关基因激活后，多倍体细胞又具备了有丝分裂的能力。如在果蝇内复制细胞中敲除细胞周期蛋白A或抑制CDH1，细胞可恢复有丝分裂。有研究发现人类和小鼠细胞在经历放射线或化学药物刺激后可模仿发育过程中的内复制周期而得以生存，但当细胞重新获得有丝分裂能力后常会发生多极分裂、染色体偏分离和胞质不分离，形成非整倍体细胞，这可能也促进了肿瘤的发生［26］。更为有趣的是有研究［27-28］发现卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、正常成纤维细胞经紫杉醇或缺氧诱导剂二氯化钴刺激后均可发生内复制，形成的多倍体巨细胞可通过与酵母类似的出芽或者碎裂的方式产生大量子细胞。这些子细胞均可以重新获得有丝分裂能力。子代肿瘤细胞甚至对细胞毒药物具有更强的抵抗能力。大量肿瘤样本的计算建模分析也表明［29］，许多肿瘤都可以进化到接近三倍体的状态，提示多倍体可能为肿瘤细胞的生长和生存提供选择性的优势。

3.3 肿瘤干细胞样特性

肿瘤细胞干细胞样特性被认为是肿瘤抵抗放、化疗及转移、复发的根源，通常认为癌细胞可以通过类似于胚胎的上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）获得干性。有研究［27，30］发现由内复制产生的多倍体瘤巨细胞（PGCCs）非常类似于胚胎卵裂球阶段的发育，具有类似胚胎的干性，不仅可表达CD44、CD133等多种胚胎干细胞标志物，还能够分化出类似于胚胎的三个胚层结构。PGCCs具有较高的可塑性，可被诱导分化为脂肪、软骨、骨等组织。来源于正常成纤维细胞的多倍体细胞甚至可形成由成纤维细胞、内皮细胞，甚至红细胞等间充质细胞组成的良性肿瘤［28，31］，其推测，在应激状态下，肿瘤细胞优先选择内复制而非有丝分裂来抵抗致死效应。内复制形成的多倍体细胞不仅能帮助肿瘤细胞得以存活并保存其DNA信息，还能使细胞去分化至胚胎发育早期阶段以获得类似于干细胞的自我更新能力，之后通过再分化促进新瘤形成，导致肿瘤复发［32］。

4 展望

目前，内复制现象的研究虽然已取得了令人鼓舞的成果，但仍有一些至关重要的问题有待系统深入地探讨，如应激状态下内复制的使动因素、参与内复制细胞周期及多倍体细胞去多倍体化调控的信号转导通路、关键环节及有效的干预靶点；能否利用PGCCs的干样特性使其分化为软骨、骨或脂肪等，促进肿瘤的良性转化等等。内复制现象有助于揭示恶性肿瘤的发生、发展，为找寻治疗肿瘤的新方法提供了潜在的新思路。