羊寄生虫病常规实验室速诊技术

范斯敏（福建省南平市建阳区动物疫病预防控制中心 354200）

随着畜牧业发展，基层兽医实验室的诊断技术不断更新，但以重大动物疫病的血清学和病原学检测为主，对基层常见的普通动物疫病的诊断检测较少。事实上，普通病种类繁多，严重影响动物健康养殖。近年来，羊的养殖量增长迅速，慢性消耗性的寄生虫病隐性存在，难以确诊，经济损失巨大，迫切需要得到及时有效的解决。本文针对羊寄生虫病剖检、粪检、染色镜检等常规兽医实验室快速诊断手段进行总结优化，以探寻适用于基层的及时有效的动物临床常见寄生虫病兽医实验室确诊技术。

1 血液寄生虫的检查

1.1 制片

取病畜高温时耳静脉血液：（1）鲜血压滴观察：于载玻片上滴一滴生理盐水，加一滴被检血液后混合充分，盖上盖玻片稍静置，于低倍镜检查发现有运动虫体后，换高倍镜检查（视野光线应稍弱）。检查虫体运动性。（2）血液涂片检查：制作血涂片，用瑞氏或姬姆萨染色镜检。用于羊伊氏锥虫、梨形虫（泰勒虫、巴贝斯虫）检查。

1.2 染色

1.2.1 瑞氏染色

由亚甲蓝和伊红配成的复合染色剂。（1）干燥后的血涂片上滴加数滴瑞氏染液，覆盖染色约1min；（2）再滴加磷酸盐缓冲液，吹匀，滞留5min；（3）缓慢摇动玻片，再从一侧流水轻轻冲去染液，用滤纸吸干（或自然干燥），镜检。

1.2.2 姬姆萨染色

（1）常用姬姆萨染色液：约8滴原液配以5ml蒸馏水稀释；（2）用甲醇固定抹片，干燥后浸入盛有染色液的染色缸中，或滴加足量染色液，染色30min，也可延长至1～24h，水洗，风干，镜检。

1.3 虫体浓集法

采抗凝血6ml，500r/min离心5min后，取上层血浆移入另一离心管（感染梨形虫的红细胞和锥虫本身比正常红细胞轻，上层血浆中含少量红细胞，白细胞和虫体），加适量生理盐水2500r/min离心10min，取沉淀制片，染色，镜检。可用于梨形虫和伊氏锥虫的检查。也可结合溶血法检查血液中的蠕虫幼虫（微丝蚴）：采血于离心管中，加入5%醋酸溶液以溶血，离心并吸取沉淀检查。

2 呼吸道寄生虫的检查

一般在难以作鉴别诊断时，或是需要证实粪便中的虫卵或幼虫属于呼吸道寄生虫时进行。用棉签取鼻腔和气管分泌物，可以通过诱咳以采集较多的检查物，将采得的黏液涂于载片上镜检。羊肺丝虫的虫卵或幼虫、肺吸虫的虫卵可出现在气管分泌物中。

3 组织寄生虫的检查

3.1 组织触片检查

一些原虫可在不同组织内寄生。组织取样一般在死后尸体剖检时进行（参见6），取一小块组织样，切面在载玻片上做成抹片、触片，或将小块组织固定后制成组织切片，染色检查。抹片或触片可用瑞氏染色或姬姆萨染色后观察（染色方法见1.2）。

3.2 组织液抹片检查

可取淋巴、腹水等组织液，制作抹片，进行显微镜检查病原体。

淋巴取样方法：保定，一手向上方推移肿大的淋巴结，另一手固定淋巴结，进行局部剪毛、消毒，用较粗的针头刺入淋巴结抽取淋巴组织，将针头内容物涂成抹片固定，染色，镜检。适用于羊泰勒虫、弓形虫的检查。羊感染泰勒虫病后，可能出现局部体表淋巴结肿大，可取淋巴组织样，镜检查出柯赫氏体（内含许多小的裂殖子或染色质颗粒）可确诊。

腹水收集方法：侧卧保定，在腹白线下侧脐前方（母畜）或后方（公畜）1～2cm做穿刺，刺入腹腔后阻力骤减，有腹水流出。取得的腹水抹片，以瑞氏液或姬姆萨染色检查。羊感染弓形虫病，可取腹水做生前诊断，检查滋养体；死后检查可取组织或体液，检查包囊和速殖子等。

3.3 其他组织检查方法

肌肉中旋毛虫检查，可用传统镜检法或消化法。（1）直接镜检法：取3mm×10mm的小块膈肌肉样0.5～1g，厚玻片压紧，镜检。（2）消化法：取100g肉样搅碎或剪碎放入3L烧杯中，加10g胃蛋白酶，溶于2L自来水；再加16ml25%盐酸，放入磁力搅拌棒约45℃搅拌30min；消化液用180μm的滤筛过滤，转入2L分离漏斗，静置30min后放40ml液体于50ml量筒内，静置10min后吸去30ml上清液；再加30ml水摇匀，10min后再吸去30ml上清液。剩下液体倒入带有格线的平皿内，用20～50倍显微镜检。

4 体表寄生虫的检查

4.1 皮肤刮取物检查 [1]

用消毒外科凸刃小刀反复刮取患处与健康部交界处的表皮，至微出血。刮时将刀子沾上甘油或甘油溶液便于集样。刮取物放于载玻片上，滴加50%甘油溶液，覆以另一张载玻片，搓压使病料散开，镜检。

提高检出率方法优化：（1）浓集法：取较多病料置于试管中，加入10%NaOH溶液煮沸融化后静置20min沉淀或以2000r/min离心5min，取沉渣镜检。（2）或将刮取到的干病料放于培养皿内，加盖；培养皿放于大约42℃温水上12min，翻转，可镜检皿底（黏附虫体与少量皮屑）。（3）或将刮取物放黑纸上置35℃温箱一段时间，收集爬出的针尖大小的黄白色点状物，镜检。适用于羊疥螨、痒螨的检查。

4.2 毛囊结节检查

检查羊眼眶四周、颊部和鼻部、四肢的外侧和腹部两侧、背部的皮肤，找到按摸有黄豆大或砂粒样的结节，用小刀切开挤压，挑取脓性分泌物或淡黄色干酪样团块置于载片上，加1～2滴生理盐水均匀涂成薄片，盖片，低倍镜镜检。适用于羊蠕形螨的检查。

4.3 吸血节肢动物寄生虫

肉眼观察：虱、蜱、蚤、虱蝇等体型较大的寄生虫。适用于羊狂蝇蛆病（检查鼻腔）、羊硬蜱病、虱病、虻病、蚤病的检查。

5 寄生虫的粪便检查

5.1 虫体和虫卵的简易检查

（1）一些寄生虫或其痕迹会随粪便排出，可用玻璃棒搅拌，直接挑出判明虫种。主要是寄生于动物消化道的寄生虫，如：绦虫的孕卵节片、线虫等。

（2）直接涂片法：载玻片上滴2滴水或50%甘油水溶液，混合黄豆大小粪块，剔除粗粪渣，加盖玻片，镜检虫卵。可用于羊各种蠕虫（包括线虫、绦虫、吸虫、棘头虫）的虫卵和球虫的卵囊检查，但检出率不高。

（3）虫体染色法：检查粪便中小而纤细的虫体：可在粪便沉渣中滴加浓碘液，使粪便和虫体均染成棕黄色，再加5%硫代硫酸钠溶液脱色，因虫体不脱色而其他物质脱色而易于辨认。

5.2 幼虫分离法（贝尔曼氏法）

用一小段乳胶管链接漏斗和小试管，置漏斗架上，漏斗内放置有被检材料（粪便或组织）的粪筛或纱布，通过漏斗加40℃温水至漏斗中部，静置1～3h，拿下小试管，弃上清液，大部分幼虫游走沉于试管底部，取管底沉淀物镜检。简单平皿法分离幼虫：取粪球若干个，置于表面玻璃或平皿内，放不超过40℃的少量温水，经15min后取出粪球，吸取皿内液体镜检幼虫。可用于蛔虫的检查和线虫的鉴别。

5.3 虫卵漂浮法

（1）饱和盐水法[2]：400g食盐溶于1000ml沸水，纱布过滤，冷却备用。漂浮时，取弄碎的10g粪便于容器中，加适量饱和盐水搅匀过滤后，静置0.5h，盖玻片直接蘸取液面后放于载玻片上，镜检；或用金属圈（0.5～1cm直径）取表面液膜，于载玻片上抖落，盖片，镜检。检查线虫卵、绦虫卵及球虫卵囊。

（2）其他饱和溶液：检查密度相对较大的虫卵，如棘头虫虫卵和吸虫卵时，需要用硫酸镁、硫代硫酸钠及硫酸锌等饱和溶液。羊隐孢子虫卵囊用饱和蔗糖溶液漂浮法。

5.4 虫卵沉淀法

5～10g捣碎后的粪便混合5～10倍清水搅匀，用铜筛（40～60孔）滤去大块物质，离心，弃上清液，加水搅匀再沉淀，反复2～3次至上层清亮。最后弃大部分上清后，留约为沉淀物1/2的溶液，用胶头吸管吹吸均匀后取少量镜检。吸虫卵、棘头虫卵密度比水大，可采用此方法检查。

6 尸体剖检

可检查全身各个器官，或检查某一器官、或某一种寄生虫。可查明动物所有组织器官中的寄生蠕虫，包括消化道、呼吸道及脑部寄生虫的检查，可弥补生前诊断法的不足，查出不排虫卵的雄虫和幼虫等，并可做到计数和种类鉴别，是寄生虫病确诊的重要手段和依据。

7 总结

7.1 染色制片镜检要点

血液制成推片；组织制成触片或抹片；渗出液、分泌物和培养物视黏稠度直接涂片，或者加适量生理盐水稀释。干燥与固定：让涂片在空气中自然干燥，或者样品面朝上，通过火焰2～3次固定（以不烫手为宜）。血涂片必须干透后固定，否则细胞在染色过程中容易脱落。

各种染色应注意：抹片滴上染色液后应直接以流水冲洗，如果先倒掉染液容易发生染料沉渣黏附。如瑞氏染料颗粒沉积在血涂片上可滴加甲醇，然后立即用流水冲洗。冲洗时间不能过久，以防脱色。

瑞氏染色过淡可复染：复染时先加缓冲液，后加染液；染色过深可用流水冲洗或浸泡，也可用甲醇脱色。油镜观察姬姆萨染色片：镜下背景为淡红色，细菌为蓝紫色，细胞质染成淡红色，细胞核为蓝紫色；作焦虫病检查时，红细胞染成淡红色，红细胞内虫体染为蓝紫色。

7.2 其他

采用新鲜排出的或直接从羊直肠挖取的粪便做检查。如粪便中虫体较多，短期内无法找完，可以将淘洗处理后的粪便沉渣加3%福尔马林保存，以便有充足时间查找更多虫体。此外，还有幼虫培养法、毛蚴孵化法，用时较长，此不赘述。

[1]汪明.兽医寄生虫学[M].北京:中国农业出版社,2003:30-38.

[2]江斌,吴胜会,张世忠.羊病速诊快治[M].福州:福建科学技术出版社,2016:14-15.