环磷酰胺联合白头翁多糖体内抗乳腺癌作用初探

刘娟 杜凌艳（通讯作者）

（乐山市人民医院 四川 乐山 614000）

乳腺癌作为一种全球女性发病率最高的恶性疾病，除早期患者选择单一的手术或放射治疗可达到治愈目的外，目前乳腺癌已进入综合治疗时代，中、晚期患者均采取手术、化疗及放疗结合治疗。环磷酰胺作为常用烷化类抗肿瘤化疗药物，在治疗恶性肿瘤、免疫性相关及器官移植等疾病中发挥重要作用。近几年，一些研究者发现高等植物提取的多糖具有抗肿瘤活性，且抗肿瘤活性与其增强免疫功能有关[1]。又因中医药安全、有效、副作用小的特点，研究者们开始将中国传统中医药作为新的抗肿瘤药物进行研究，天然植物防治乳腺癌的临床与实验研究正逐步引起世人的关注[2-3]。

白头翁（Radix Pulsatillae）清热解毒、凉血止痢，现代医学证实[4]其具有抗炎、抗菌、抗肿瘤及调节免疫的作用。目前对白头翁的抗肿瘤药理作用研究成为焦点[5]。

1.材料

动物：BALB/c小鼠，SPF级，雌性，体重18～20g，购于军事医学科学院实验动物中心（SCXK-（军）2016-004）。

细胞株：4T1乳腺癌细胞，购于中国医科院肿瘤细胞库。

试验用药：环磷酰胺（CTX），上海华联制药有限公司产品（批号：20160916）；白头翁草药由本院中药房提供，符合国家药典正品标准。

2.方法

2.1 白头翁多糖的提取

多糖提取时由于真空浓缩，产品黏着于瓶子内壁，造成收率较低，利用无水乙醇进行改良提取[6]。

取粉碎好的白头翁100g，浸泡1h，3次煎煮（100℃，6h/次）后过滤，常压浓缩至2/3体积，2500r/min离心30min，收集上清。真空浓缩后再次离心，待浓缩液成为糖浆状后转移至离心管，以无水乙醇少量多次溶解挂壁糖浆，并收集在同一离心管，静置30min离心，冷冻干燥至恒重，得白头翁多糖RP。

2.2 4T1细胞培养和乳腺癌荷瘤小鼠模型的建立[7]

以RPMI-1640培养基（胎牛血清10%；青霉素、链霉素100µg/ml）培养4T1肿瘤细胞，每隔3至4天分瓶传代，将处于对数生长期的肿瘤细胞用于体内肿瘤的接种。PBS重悬细胞，浓度为1x107/ml，100ul/只，接种于实验动物右侧胁肋处。

2.3 实验分组及给药

待肿瘤体积长至100mm3时随机分为四组：空白对照组（Vehicle），CTX（25mg/kg）组，CTX+RPL（25+50mg/kg）和CTX+RPH（25+100mg/kg）组，每组10只。RP灌胃给药，CTX腹腔注射，连续给药12天，Vehicle组灌服等剂量蒸馏水。

2.4 观察指标

每天称量小鼠体重，每周三次游标卡尺测量肿瘤的长、短径，体积计算公式为：体积=0.536×长径×短径2，绘制小鼠体重及肿瘤体积变化图[8]。

实验结束时剥离瘤体，称重，计算抑瘤率[10]；解剖获得脾脏、胸腺，对其进行重量分析，计算脾脏（胸腺）指数[9]。

2.5 统计学方法

应用统计学SPSS 17.0软件进行数据分析[11]，单因素方差解析，以P＜0.05表示具有统计学意义。

3.结果

3.1 体重分析

给药过程中，动物一般状态良好，未表现明显的体重降低。给药6天至实验结束，由于肿瘤体积的迅速增长，各治疗组体重均显著低于Vehicle组（P＜0.05），且CTX与CTX+RPH组间，体重差异具有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 实验动物体重变化曲线

3.2 肿瘤体积变化

给药一周后，各治疗组表现出明显的抗肿瘤活性（P＜0.01），但各组间无显著性差异；实验结束时，各治疗组肿瘤体积显著低于Vehicle组，且与CTX组相比，CTX+RPL、CTX+RPH组抗肿瘤作用差异具有统计学意义（P＜0.01），CTX+RPL、CTX+RPH组间抗肿瘤作用差异具有显著性（P＜0.05），见图2。

图2 肿瘤生长曲线

3.3 瘤重及抑瘤率

与Vehicle组相比，各治疗组肿瘤重量均显著降低（P＜0.01），抑瘤率明显提高（P＜0.05，P＜0.01）；此外，与CTX组比较，CTX+RPH组肿瘤重量显著降低（P＜0.05），抑瘤率明显升高（P＜0.05）；与CTX+RPL组相比，CTX+RPH组抑瘤率差异不明显，整体趋势与肿瘤体积基本一致，见表1。

表1 肿瘤重量及抑瘤率

3.4 脾脏及胸腺指数

与Vehicle组相比，CTX治疗导致各组小鼠的脾脏及胸腺指数水平明显降低，而RP参与治疗可逆转此趋势，其中CTX+RPH组对脾脏指数的升高具有显著性差异（P＜0.05）。RP对胸腺指数水平虽有一定程度的升高，但此升高作用无统计学意义，见表2。

表2 各组脾脏指数及胸腺指数

4.讨论

此研究探讨环磷酰胺联合白头翁多糖对4T1乳腺癌移植瘤模型的抗肿瘤活性，结果表明环磷酰胺对小鼠乳腺癌抑瘤作用明确，白头翁多糖能够提高环磷酰胺的抗肿瘤作用，而且在一定程度上提高了小鼠的免疫力。

当代社会乳腺癌严重危害着女性的身心健康，对其研究已经成为人类社会关注的焦点。环磷酰胺作为广谱的抗癌药物，能够明显抑制肿瘤生长，但其免疫抑制作用应引起重视，即杀伤肿瘤的同时对正常组织器官造成不同程度的损伤。本研究亦证明，环磷酰胺对荷瘤鼠的免疫器官（脾脏、胸腺）有较强的抑制作用，因此，寻找一种能够实现增效减毒作用的辅助药物具有重要意义。

研究报道[12-13]显示，白头翁多糖具有一定的抗肿瘤活性，并拮抗CTX导致的吞噬功能抑制。本研究显示，单用CTX组荷瘤鼠脾脏和胸腺指数明显下降，与白头翁多糖联合用药后，增强抑瘤作用的同时，脾脏和胸腺得到了缓解，且在一定的浓度范围内，白头翁多糖给药量越高，指数提高越显著。

本研究对环磷酰胺联合白头翁多糖的体内抗乳腺癌作用进行了初步探对，验证了环磷酰胺的抗乳腺癌作用，亦验证了白头翁多糖对环磷酰胺的增效减毒作用，为降低环磷酰胺的副作用提供可行的临床治疗方案，打破其因不良反应而被限制应用的僵局。同时对于弘扬祖国传统医学、中药现代化具有重要意义，并对完善天然化合物抗乳腺癌研究提供一定的理论基础。

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