Piwil2调控宫颈癌细胞恶性生物学行为的机制探讨

冯定庆，闫克芹，张 筱，邓 琳，凌 斌

中日友好医院妇产科，北京 100029

Piwil2属于PIWI/AGO家族，位于人类第8号染色体，在胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)和生殖干细胞(germline stem cells，GSCs)中广泛表达，对干细胞自我更新和分化具有重要的调控作用［1-2］。出生后的正常个体，Piwil2仅表达于睾丸生精细胞，其他组织均未见表达，而在各种肿瘤组织和肿瘤细胞系可见Piwil2重新表达，被认为是一种新的肿瘤睾丸抗原(cancer-testis antigen，CAT)［3-5］。我们的前期研究结果显示，在正常宫颈组织和宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)1病变中未见Piwil2，CIN2-3病变及宫颈癌组织中重现Piwil2表达［2］，并且Piwil2是宫颈癌干细胞一个重要的分子标志［6］。进一步的研究证实，Piwil2通过表观遗传途径促进转录因子c-myc、nanog、sox2和oct4表达而启动细胞重编程［2］。然而，Piwil2表达与宫颈癌恶性生物学行为及肿瘤进展之间的关系，目前尚不清楚。

本研究试图通过在宫颈癌细胞HeLa和SiHa中分别沉默和过表达Piwil2，观察细胞恶性生物学特性的改变，并深入探讨其可能的分子机制，以期进一步完善宫颈癌的发病机制，并为宫颈癌的治疗寻找新的靶点。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

高糖DMEM、RPMI-1640、胎牛血清(fetal calf serum，FCS)、TRIzol试剂盒、LipofectamineTM3000、蛋白酶抑制剂混合物、BCA蛋白定量试剂盒和ECL显色试剂盒均购自美国ThermoFisher公司，碘化吡啶(propidium iodide，PI)、RNase A、Hoechst 33342、嘌呤霉素和维拉帕米(verapamil)购自美国Sigma公司，慢病毒载体pLenti-CMV-Piwil2-SV40-EGFP、对照病毒pLenti-EGFP购自上海吉凯基因化学技术有限公司，shPiwil2质粒(TG302470)、随机序列shRNA质粒(TR30013)购自美国OriGene公司，Random Primer、反转录酶和PCR试剂盒Premix Taq均购自宝日医生物技术(北京)有限公司，顺铂(规格20 mL：20 mg)由南京制药厂有限公司提供，CCK-8试剂盒购自东仁化学科技(上海)有限公司，Stat3(#9132)、p-Stat3(#9145)和GAPDH(#2118)一抗购自美国Cell Signaling公司，Piwil2(ab85084)一抗购自美国Abcam公司，P53(BM0102)和cyclin D1(BA0770)一抗购自武汉博士德生物工程有限公司，所有二抗均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 细胞培养及转染

宫颈癌细胞株HeLa和SiHa购自美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)，高糖DMEM(含10%FCS、100 U/mL青霉素和 100 μg/mL链霉素)、于37 ℃、CO2体积分数为5%的饱和湿度条件下培养。① 过表达Piwil2：收集对数生长期细胞，1×104个细胞接种6孔板，6 h后细胞贴壁，过表达Piwil2组细胞转染pLenti-CMV-Piwil2-SV40-EGFP，对照组细胞转染pLenti-EGFP；② 沉默Piwil2表达：收集对数生长期细胞，5×103个细胞接种96孔板；第2天，采用LipofectamineTM3000转染shPiwil2质粒，对照组转染随机序列shRNA质粒，1 μg/ mL嘌呤霉素压力筛选获得稳定转染细胞；荧光观察、反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)及蛋白［质］印迹法(Western blot)检测转染效果。前期实验结果证实［2］，对照病毒pLenti-EGFP和随机序列shRNA质粒转染对Piwil2表达及细胞生物学特性均无显著影响，故将转染前的HeLa和SiHa细胞作为相应的统一对照。

1.3 反转录及PCR

收集对数生长期细胞，经TRIzol充分裂解后提取总RNA并定量，取2 μg总RNA作为模板，按照反转录酶说明书操作获得cDNA；取1 μL cDNA、上下游引物各1 μL、Premix Taq 12.5 μL、去离子水补足反应体系至25 μL，PCR扩增条件：94 ℃解链1 min，94 ℃ 30 s、56 ℃30 s、72 ℃ 45 s，共34个循环；扩增结束，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳、观察结果。其中，PCR引物由宝日医生物技术(北京)有限公司合成，引物序列见表1。

表 1 PCR引物序列Tab. 1 PCR primer sequence

1.4 细胞增殖的检测

收集对数生长期HeLa和SiHa细胞，每100 μL 2×103个细胞接种于96孔板，分别于接种后24、48、72和96 h向各孔内加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃继续培养4 h，振荡混匀(不可产生气泡)，酶标仪上读取450 nm处吸光度(D)值。实验重复3次。

1.5 细胞周期检测

收集对数生长期细胞，将1×106个细胞加入预冷70%乙醇1 mL，于-20 ℃温度下固定过夜。预冷1×PBS洗涤细胞2次，15 000×g离心5 min，弃上清液。50 μg/ mL PI(含250 μg/mL RNase A，0.02% Triton X-100)500 μL重悬细胞，室温避光染色30 min，并采用流式细胞术(fluorescent-activated cell sorting，FACS)进行检测。

1.6 侧群(side polulation，SP)细胞检测

肿瘤组织中的SP细胞具有肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)特性，通过细胞膜上ABC转运蛋白将荧光染料Hoechst 33342外排而发生拒染，维拉帕米则可阻断ABC转运蛋白的功能；SP细胞与肿瘤发生、发展、耐药及转移密切相关［7］。为探讨Piwil2表达对宫颈癌细胞中SP细胞比例的影响，分别收集HeLa、SiHa及相应沉默和过表达Piwil2细胞，每组细胞分为2份，含2%FCS RPMI-1640重悬细胞，调整细胞密度为1×106个/mL。加入终浓度为5 μg/ mL Hoechst 33342，其中一份细胞同时加入100 mmol/L维拉帕米，37 ℃避光水浴90 min(期间，每隔15 min轻微振荡数秒)。冰上10 min终止染色，含2%FCS预冷的RPMI-1640洗涤、重悬细胞，FACS检测前加入终浓度为2 μg/mL PI。355 nm UV激发光，610 nm双色短通反射滤镜，450和675 nm下分别检测蓝光和红光，分析SP细胞比例。

1.7 Western blot检测蛋白表达

1%NP40(含蛋白酶抑制剂和PMSF)裂解细胞提取总蛋白，取40 μg蛋白上样，10%SDS-PAGE分离，15 V 20 min半干转至PVDF膜。5%脱脂奶封闭2 h，一抗4℃温育过夜，TBST洗涤后加入对应二抗，室温温育2 h，TBST洗涤、ECL显色、凝胶成像系统分析结果。

1.8 顺铂敏感性检测

收集对数生长期细胞，1×104个细胞接种96孔板，6 h后分别加入连续梯度浓度的顺铂(0～24 μg/mL)，48 h后采用CCK-8试剂盒检测细胞存活率，绘制顺铂杀伤曲线，比较HeLa和SiHa细胞过表达/沉默Piwil2基因后对顺铂的敏感性变化。

1.9 统计学处理

2 结 果

2.1 Piwil2促进宫颈癌细胞增殖

HeLa和SiHa细胞转染慢病毒载体pLenti-CMV-Piwil2-SV40-EGFP，48 h后荧光显微镜下可见EGFP表达，转染效率达90%以上；宫颈癌细胞转染shPiwil2质粒，采用1 μg/mL嘌呤霉素持续压力筛选2周后，可以获得稳定转染细胞；RT-PCR和Western blot结果显示，在HeLa和SiHa细胞Piwil2过表达和沉默效果均良好(图1A、B)。细胞增殖实验结果显示，过表达Piwil2显著促进宫颈癌细胞增殖，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)；而沉默Piwil2基因后，与对照组细胞相比，细胞增殖则被显著抑制(P＜0.01，图1C、D)。

图 1 过表达和沉默Piwil2基因对宫颈癌细胞增殖能力的影响Fig. 1 The over-expression and silencing of Piwil2 gene affected cervical cancer cell lines proliferation

2.2 Piwil2影响宫颈癌细胞周期

细胞周期检测结果显示，HeLa细胞G0/ G1期、S期和G2/M期细胞比例平均分别为58.92%、37.58%和3.50%，过表达Piwil2后，G0/ G1期细胞比例(47.09%)显著减少，S期和G2/M期细胞比例(45.64%和7.27%)显著增加，与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.01，P＜0.05)；沉默Piwil2基因后，则G0/G1期细胞比例(66.84%)显著增加，沉默前后差异有统计学意义(P＜0.01)。SiHa细胞过表达和沉默Piwil2基因后，G0/G1期、S期和G2/M期细胞比例变化趋势与HeLa细胞一致。结果表明，Piwil2加快了宫颈癌细胞周期，促进细胞增殖，沉默Piwil2基因则使细胞发生细胞周期阻滞(图2)。

2.3 细胞周期相关调控蛋白的表达

进一步分析Piwil2促进宫颈癌细胞增殖的分子机制，Western blot结果显示，宫颈癌细胞过表达Piwil2后，Stat3磷酸化水平增加，细胞周期调控蛋白cyclin D1表达增加，P53的表达水平则显著降低；沉默Piwil2基因表达，则结果相反。过表达和沉默Piwil2基因前后，Stat3表达无显著变化(图3)。

2.4 Piwil2上调宫颈癌细胞中SP细胞比例

FACS结果显示，HeLa和SiHa细胞SP细胞比例分别为3.01±0.30和2.07±0.21，过表达Piwil2后，SP细胞比例均显著增加(6.28±0.52和4.20±0.50)，而沉默Piwil2基因表达则显著降低了SP细胞比例(1.03±0.20和1.14±0.31)，与对照组细胞比较差异均有统计学意义(P＜0.01，图4)。

2.5 Piwil2促进宫颈癌细胞耐药

HeLa细胞及其沉默、过表达Piwil2基因后，顺铂对它们的半数致死量(median lethal dose，LD50)分别为4.78、3.52和8.97 μg/mL，与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05和P＜0.01，图5A)。SiHa细胞及沉默、过表达Piwil2基因后，顺铂LD50值分别为10.21、6.06和18.64 μg/mL，与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.01，图5B)。

图 2 FACS检测HeLa和SiHa细胞过表达或沉默Piwil2后细胞周期变化Fig. 2 The cell cycle of HeLa and SiHa was analyzed by FACS

图 3 Westorn blot检测pStat3、cyclin D1和P53的表达Fig. 3 The expression levels of pStat3, cyclin D1 and P53 measured by Western blot

3 讨 论

Piwil2正常表达于ESCs和GSCs，而作为一种CAT，在肿瘤组织和肿瘤细胞系中的表达主要在其中的癌前干细胞(precancerous stem cells，pCSCs)和CSCs群体中，Piwil2已经被认为是pCSCs/CSCs特异标志物之一［2,6,8-9］。我们前期的研究发现，高危型HPV致癌蛋白E6/E7能够重启Piwil2表达，继而通过表观遗传途径使体细胞发生重编程，促进肿瘤起始细胞(tumor-initiating cells，TICs)形成，在宫颈癌发生中起重要作用［2］。本实验的结果显示，HeLa和SiHa细胞过表达Piwil2后，群体中SP细胞比例显著增加，而沉默Piwil2基因则显著降低SP细胞比例，再一次验证了前期的研究结果。肿瘤干细胞是肿瘤发生、进展、转移、耐药和复发的根源，宫颈癌的进展程度与Piwil2表达水平密切相关。

Piwil2具有强大的基因表达调控功能，通过piRNA结合目标mRNA，Piwil2可发挥核酸内切酶的功能降解mRNA［1，10］；Piwil2还可以募集HP1、组蛋白甲基转移酶等，通过表观遗传修饰途径调控基因表达［11-13］；Piwil2还可以与微核糖核蛋白粒子(micro ribonucleoprotein particle，miRNP)结合，发挥转录后调控作用［13］。宫颈癌细胞过表达Piwil2后，p53蛋白水平显著降低，cyclin D1表达上调，并且Stat3的磷酸化水平也显著增加，沉默Piwil2基因则效果相反。p53、cyclin D1、pStat3参与调控细胞周期，与细胞增殖密切相关［14-16］。这些基因表达的改变，正好是Piwil2调控细胞增殖及细胞周期变化的分子基础。我们的实验结果显示，过表达Piwil2促进宫颈癌细胞增殖，显著增加S期和G2/M期细胞比例，沉默Piwil2基因则引起细胞脱离细胞周期、阻滞于G0/G1期、从而抑制宫颈癌细胞增殖。

图 4 FACS检测Piwil2表达对HeLa和SiHa细胞中SP细胞比例的影响Fig. 4 Identification of SP cells and analyses the proportion with FACS

图 5 Piwil2对HeLa和SiHa细胞顺铂杀伤敏感性的影响Fig. 5 Piwil2 affected the sensitivity of HeLa and SiHa cells to cisplatin

另外，化疗药物杀伤实验结果显示，Piwil2还可以引起HeLa和SiHa细胞对顺铂敏感性降低，促进化疗药物抵抗。分析原因，可能与Piwil2促进SP细胞转化，提高了SP细胞比例有关，以及与Piwil2显著提高肿瘤细胞增殖活性、抑制细胞凋亡、上调耐药基因表达等因素有一定关系［2,6,17］。相反，沉默Piwil2基因则显著降低肿瘤细胞LD50值，显著提升顺铂的杀伤效率。

因此，Piwil2的表达在宫颈癌的发生、进展及耐药中发挥重要作用，Piwil2有望成为一个潜在的宫颈癌治疗靶点。

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