双功能单体法制备磁性奥硝唑分子印迹聚合物及应用

廖素兰 陈少云+刘奇琳+陈良壁+李晓敏

摘要采用悬浮聚合法，以奥硝唑（ONZ）为模板分子、 甲基丙烯酸（MAA）和丙烯酰胺（AA）为双功能单体、 二甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA）为交联剂，利用Fe3O4磁性纳米粒子制备了奥硝唑磁性分子印迹聚合物（MMIPs）。通过扫描电子显微镜（SEM）、 红外光谱（FTIR）、 磁化强度分析（VSM）、 紫外可见吸收光谱 （UVVis）及热重分析（TGA）等对合成的聚合物进行了表征。结果表明，双功能单体MMIPs对奥硝唑的吸附量高于相应的单功能单体MMIPs； 对类似物质也有一定的吸附能力。利用等温吸附数据进行 Scatchard 分析，从而推断出MMIPs对于模板分子的作用存在两种不同的结合位点，最大吸附量Qmax1为4896 μmol/g，Qmax2为1060 μmol/g。结合高效液相色谱分析技术，将所制备的MMIPs应用于河水样品中硝基咪唑类抗生素的提取富集，加标回收率为854%～1043%，方法简便易行、 准确可靠。

关键词双功能单体； 磁性分子印迹； 硝基咪唑类药物； 高效液相色谱； 固相萃取

1引 言

硝基咪唑（Nitroimidazoles）是一类含有5硝基咪唑环结构的化合物，主要有甲硝唑（Mertonidazole，MNZ）、 二甲硝咪唑（Dimetridazole，DMZ）、 罗硝唑（Ronidazole，RNZ）、 奥硝唑（Ornidazole，ONZ）和塞克硝唑（Secnidoazel，SNZ）等， 曾广泛用于医疗和畜牧养殖业。然而其滥用已对食品安全及环境构成威胁，许多国家及地区已禁止该类药物用于食源性食物，我国也于 2002 年禁止该药物的使用[1]。但是仍有非法使用的事件发生，且由于硝基咪唑类药物难以被生物降解，在各种水体中已被检测到 [2]，其残留分析也成为当前关注的热点之一[3～14]。实际样品中硝基咪唑的含量一般较低，且基质成分复杂，通常在检测之前需对实际样品进行预富集。常用的预富集方法为固相萃取法，具有操作简便、 快速、 溶剂使用量少等特点，但选择性差[3～7]。分子印迹聚合物（MIPs）模拟抗原和抗体的识别，拥有在形状、 尺寸和官能团与模板分子相匹配的分子识别空穴。基于分子印迹技术的分子印迹聚合物对特定的分析物或一组结构相关的化合物具有高的选择性和亲合性[12，13]。磁性分子印迹聚合物（MMIPs）兼具磁响应性材料和分子印迹聚合物的优点，在外加磁场的条件下，可以直接选择性分离富集分析物，分离更加简单有效，无需额外的离心或过滤，在痕量污染物萃取分离领域展现了非常优越的性能，已逐渐成为样品前处理中最具有应用前景的研究方向之一[9]。

传统的基于甲基丙烯酸（MAA）分子印迹聚合物的制备，通常采用MAA为单功能单体。然而，采用双功能单体，已被证实可以提高分子印迹聚合物的模板识别能力[14，15]，饶维等[15]以β环糊精和4乙烯基吡啶为双功能单体，成功合成了对双酚A具有特异吸附性能的磁性印迹复合材料。磁性分子印迹聚合物的合成方法有悬浮聚合法、 乳液聚合法、 基于硅胶表面修饰的磁性分子印迹方法等[16～18]。基于硅胶表面修饰的磁性分子印迹方法，制作过程费时繁琐[9]； 乳液聚合法包覆的磁性粒子易泄漏[17]； 悬浮聚合法具有方法简单、 吸附力强等优点[17]。基于此，本研究以甲基丙烯酸（MAA）和丙烯酰胺（AA）为双功能单体、 二甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA）为交联剂，采用悬浮聚合法制备了新型磁性奥硝唑（ONZ）分子印迹聚合物，考察了其对奥硝唑及类似物的吸附性能，将制备的MMIPs用于环境样品中硝基咪唑类抗生素多残留的选择性识别与分离，效果良好。相比于现有的方法，本方法简便易行、 可批量化进行前处理，成本低，结果准确可靠。此磁性印迹固相萃取技术为环境水样中痕量硝基咪唑类抗生素残留的分离富集及检测提供了有效的新方法。

2实验部分

21仪器与材料

UV3200紫外可见分光光度计（上海美谱达有限公司）； VEGA3 SBH扫描电子显微镜（捷克 TESCAN公司）； SDTQ600同步热分析仪（美国TA公司）； AVATAR330傅立叶红外光谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）； 1260 型高效液相色谱仪（美国 Agilent公司），配Agilent C18柱（250 mm × 46 mm， 5 μm）； 7410樣品振动磁强计（美国LakeShore公司）。

ONZ （990%）、 ONZ、 MNZ、 SNZ标准品（大连美仑生物技术有限公司）； DMZ、 RN标准品Z（百灵威科技有限公司）； MAA（东京化成工业株式会社）； AA、 EDMA、 FeCl2·4H2O （阿拉丁公司）； FeCl3·6H2O、 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和偶氮二异丁腈（AIBN）（美国Sigma公司）； 油酸（DC，85%，上海晶化试剂有限公司）； 甲醇（色谱纯）； 其它试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。河水水样收集于武夷山自来水水源地。

22实验方法

221奥硝唑磁性分子印迹聚合物的制备参考文献[19]方法合成Fe3O4纳米颗粒。称取Fe3O4纳米颗粒25 g，加入油酸25 mL，匀速振荡得到油酸修饰的Fe3O4纳米颗粒。将10 mmol ONZ、 20 mmol MAA和20 mmoL AA溶于125 mL甲醇和125 mL丙酮的混合液，加入16 mmoL EDMA、 025 g AIBN及油酸修饰的Fe3O4纳米颗粒，混匀，转入含01 g PVP的25 mL甲醇和丙酮混合液与1 mL水的混合溶液中。搅拌下通N2，60℃聚合24 h。分别用甲醇冰乙酸（9∶1，V/V）、 甲醇及水充分洗去印迹分子及未聚合的单体，真空干燥。同法制备MNIPs，只是不加模板分子。MMIP1、 MMIP2、 MMIP3和相应的MNIPs，按表1所列的组成，以同样的方法合成。endprint

222吸附实验动态吸附实验： 将10 mg MMIPs或MNIPs分散在5 mL 004 mmol/L ONZ乙醇溶液，在25℃恒温振荡，在一定时间间隔 （10、 20、 30、 40、 50、 60、 90、 120、 150和180 min）内磁性分离，检测上清液中ONZ含量。

硝基咪唑类药物吸附实验： 在每支含10 mg MMIPs或MNIPs试管中分别加入5 mL浓度为001、 0015、 002、 0025、 003、 0035、 004、 0045和005 mmol/L ONZ （MNZ或SNZ）的乙醇溶液，在25℃下恒温振荡24 h后，磁性分离，检测上清液中硝基咪唑药物含量。

根据下式计算吸附容量Q （μmol/g）：

Q=[V× （C0-CS）] ×103/m

式中，C0（mmol/L）和CS（mmol/L）分别为测试溶液的初始浓度和平衡浓度，V （L）为溶液体积，m （g）为吸附材料的用量。取3次测定平均值进行计算。

223色谱条件流动相A为5 mmol/L乙酸铵溶液（pH 30），流动相B为甲醇。梯度洗脱程序： 0～5 min，76%～76% A； 5～6 min，76%～65% A； 6～8 min，65%～53% A； 8～9 min，53%～76% A。检测波长315 nm，流速10 mL/min，柱温39℃，进样量5 μL。

224磁性固相萃取水样经045 μm滤膜过滤，调节至pH 60，将500 mL水样与120 mg经甲醇活化及去离子水清洗的MMIPs混合，振荡富集10 h后磁场分离； 收集的MMIPs加入30 mL 80%甲醇溶液（pH 20）洗脱，收集洗脱液，于40℃下N2吹干，用10 mL甲醇溶解，045 μm滤膜过滤，用于HPLC 测定。

3结果与讨论

31功能单体的选择

如表1所示，MMIP1、 MMIP2、 MMIP3和相应的MNIPs表现出不同的吸附能力，MMIPs对ONZ的吸附量均大于相应的MNIPs吸附量，MMIPs吸附能力顺序为MMIP1>MMIP3>MMIP2，可能是由于酸性MAA的羟基易与硝基咪唑环上氮形成氢键，碱性AA的酰氨基易与硝基咪唑上羟基等形成氢键，功能单体优势互补，有助于提高聚合物对模板分子的吸附性，因此，双功能单体印迹聚合物比单一功能单体对模板分子表现出更好的吸附能力。

32MMIPs的结构表征

321奥硝唑磁性印迹聚合物的形态、 粒径及组成制备的MMIPs与MNIPs形貌相似，MMIPs由许多大小均匀的微球组成（图1A， 图1B），分子印迹聚合物包覆在黑色磁性粒子表面（图1C， 图1D）。MMIPs表现出明显的超顺磁性，无剩磁、 磁滞和矫顽磁力（图2A）。在外界磁场下，MMIPs可以迅速地与溶液分离，满足磁性分离的要求（图2A插图）。红外光谱（图2B）中，581和584 cm

322热重分析（TGA）由图3可见，在0℃～302℃内，MMIPs的热稳定较好，不易产生分解，对应的失重率为129%，主要是游离水的失重； 302℃～650℃时，MMIPs出现较大的失重，失重率为821%，是由于包裹磁颗粒的聚合层分解。上述结果与文献[22]的结论基本一致。

33MMIPs的吸附性能

331动态吸附由图4可见，ONZ浓度为004 mmol/L时，在0～60 min内，MMIPs和MNIPs对ONZ的吸附量都随着时间的延长而不断变大，MMIPs的吸附量在60 min时达670 μmol/g，因为吸附剂表面大部分为空的结合位点，模板分子与吸附剂易于结合； 60 min后，吸附量基本不变，达到吸附平衡。在动态吸附过程中，分子印迹聚合物的吸附量明显高于非分子印迹聚合物。

332聚合物对硝基咪唑类药物的吸附性能测定了磁性分子印迹聚合物对001～005 mmol/L浓度范围的ONZ及其结构类似物MNZ和SNZ的静态吸附性能。由图5可见，随着初始浓度增大，分子印迹聚合物和非印迹聚合物的吸附量呈上升趋势。相同初始浓度下，MMIPs对3种物质吸附量的顺序为： QONZ>QSNZ>QMNZ，与物质和模板的相似程度一致，MMIPs对模板分子及类似物的吸附量明显大于相应MNIPs，这是由于MMIPs经洗脱留下了与模板功能基以及空间结构大小相匹配的空穴，赋予了MMIPs对模板及类似物的特异识别性能。

34Scatchard分析

采用Scatchard模型对MMIPs的吸附性能作进一步分析，公式如下：

Q/C=（Qmax-Q）/Kd

其中，Qmax（μmol/g）为MMIPs的最大表观吸附量，Kd（μmol/L）为MMIPs的平衡离解常数，Q （μmol/g）为MMIPs在每个浓度下的平衡吸附量。

由图6可见线性关系良好的两条直线，说明MMIPs对于模板分子的作用力是两种不同的方式，存在两种不同的结合位点。两段直线的线性回归方程分别为： Y1=

Symbolm@@ 4896X1+38656，Kd=38656 μmol/L，Qmax=4896 μmol/g； Y2=

Symbolm@@ 1060X2+24909，Kd=24909 μmol/L， Qmax=1060 μmol/g。

35方法的分析性能

在优化的条件下，分别对MNZ、 RNZ、 DMZ、 SNZ和ONZ系列混合标准物水溶液进行萃取和HPLC分析，各物质的线性范围、 线性相关系数、 检出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）見表2。

36实际样品分析

将本方法用于河水样品中硝基咪唑样品的测定，由图7可见， 样品经MMIPs萃取后， 可有效去除基质干扰。从表3可见，两个水平的加标回收率为854%～1043%，相对标准偏差为12%～75%，表明制备的MMIPs能够有效分离富集环境水样中的硝基咪唑类抗生素。endprint

References

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AbstractThe magnetic molecularly imprinted polymers （MMIPs） was synthesized by suspension polymers technique using ornidazole （ONZ） as template， and methacrylic acid （MAA） and acrylamide （AA） as the binary functional monomers The MMIPs were characterized by means of scanning electron microscopy （SEM）， Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR）， vibrating sample magnetometer （VSM）， thermogravimetric analysis （TGA） and ultravioletvisible （UVVis） spectrophotometer The results indicated that the adsorption capacity of MMIPs using the binary functional monomers to ONZ was higher than that using single functional monomer or that of its structural analogues The Scatchard plot revealed that the template polymer system had a twosite binding behavior and the MMIPs exhibited the maximum rebinding to ONZ at 4896 μmol/g and 1060 μmol/g Combined with high performance liquid chromatographic analysis technology， the prepared MMIPs were successfully applied to extract and enrich trace nitroimidazoles from river water samples with recoveries range of 854%-1043% The precision of the results was good， and the manipulation of the developed method was simple and fast comparing to other methods

KeywordsDual functional Monomers； Magnetic molecularly imprinted； Nitroimidazoles； High performance liquid chromatography； Solid phase extractionendprint