尖锐湿疣亚临床感染HPV分型与预后的关系

姚明珠，李俊兰，赖洪涛

(梅州市人民医院风湿皮肤科1、皮肤科2，广东梅州514000)

尖锐湿疣(condyloma acuminatum，CA)是因为乳头瘤空泡病毒(human papillomavirus，HPV)A属感染导致的外阴以及肛门周围等出现疣状增生性损伤，属于性病中发病率最高的疾病[1]。经检测人乳头瘤空泡病毒结构主要为一种直径为50 nm左右的环状双链无包膜DNA，大概有8 kb[2]。根据DNA结构上L1区保守序列编码不同可以将HPV分为很多亚型，目前经证实的HPV亚型有将近100多种亚型，其中有将近40多种亚型与人生殖道感染有密切关系[3]。研究发现，不同的基因型HPV感染后对人体生殖器官受损程度不一，故患者预后往往不同[4]。本研究选取尖锐湿疣亚临床感染患者外生殖器部位典型优体皮损进行HPV分型，观察临床上较为常见的尖锐湿疣亚临床感染HPV亚型及其与患者预后相关性，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2015年4月至2016年12月在梅州市人民医院风湿皮肤科进行初诊诊断为典型CA患者158例(典型组)和CA亚临床感染并且未经治疗的患者108例(亚临床组)。纳入标准：①患者醋酸白试验阳性，符合卫生部制定的典型尖锐湿疣及亚临床感染型的诊断标准；②患者在确诊前未经过任何私自治疗；③排除生殖器以及肛周其他感染性疾病；④排除系统性疾病患者。158例典型CA患者中男性102例，女性56例；年龄18～55岁，平均(29.27±8.82)岁；病程6～62 d，平均(29.18±9.97)d。患者皮损活检取材位置包括包皮(58例)、阴茎冠状沟(51例)、大阴唇(29例)以及肛周(20例)。108例CA亚临床感染患者中男性74例，女性34例；年龄18～51岁，平均(28.54±8.16)岁；病程6～58 d，平均(28.64±10.51)d。患者皮损活检取材位置包括包皮(42例)、阴茎冠状沟(42例)、大阴唇(16例)以及肛周(8例)。

1.2 检测方法

1.2.1 样本溶液制备取材范围为典型尖锐湿疣疣体或者疣体周围经醋酸白试验阳性区域。在取材过程中应该避免所取的标本与尖锐湿疣亚临床期皮损出现交叉污染情况。取材完毕后用生理盐水将皮损处进行反复冲洗8～10次，以避免出现交叉感染。将所取得的标本置入洗脱管中进行捣碎，加入蒸馏水后进行充分漂洗，取漂洗后的混浊液上离心机以13 000 r/min进行离心10 min，弃上清后加入50 μL裂解液并进行吹打混匀，然后将混合液置入水浴箱以100℃温度进行孕育10 min，室温下冷却后上离心机以13 000 r/min进行离心10 min，取上清液待用。

1.2.2 HPV基因分型检测向PCR反应管中分别加入5 μL样品和20 μL缓冲液，以下列条件：50℃，15 min；95℃，10 min；然后以94℃，30 s；42℃，90 s；72℃，30 s进行扩增，反复重复40次以后，在72℃下延伸5 min。然后抽取5 mL加入进离心管中，再加入pH值为7.4的SSC和0.1%SDS 5 mL混合A液5 mL，充分振荡后置入水浴箱中，100℃下加热10 min后置入杂交箱以51℃下进行孵育1 h，然后将膜条转移至pH值为7.4的0.5×SSC和0.1%SDS的B液中，在杂交箱中以51℃下进行充分混匀。然后冷却加入1：2 000的POD溶液在室温下摇晃30 min，吸取上液后弃掉，再加入混合A液后轻轻震荡5 min，然后弃掉上清，继续重复此步骤一次。在加入0.4 mol柠檬酸钠，轻轻振荡2 min后弃掉。将膜条浸入0.1 mol柠檬酸钠19 mL，TMB 1 mL和3%的过氧化氢10 μL混合显色液，置于避光箱中孵育1 h。用蒸馏水对膜条进行冲洗，观察膜条的蓝色斑点位置。观察蓝色斑点位置，若出现在PC位点则认为有效，否则则认为实验污染。最终可测得21种亚型，包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13种高危亚型和6、11、41、42、44等5种低危亚型。

1.3 研究方法患者在治疗后第一个月每周进行复查一次，确定患者无复发现象则改为每两周复查一次，期间若发现新发尖锐湿疣病灶或者行醋酸白试验阳性亚临床感染病灶则需要再次手术。以最后1次手术结束为起始观察6个月，未发现新生尖锐湿疣病灶及醋酸白试验阴性者为临床治愈。将所测的阳性患者HPV基因分型后进行分组，择取同一亚型为一组，了解各组的复发情况。

1.4 观察指标分析尖锐湿疣亚临床感染HPV-DNA类型以及感染情况，并与典型尖锐湿疣进行比较。观察亚临床感染不同类型HPV出现顽固性复发情况。

1.5 统计学方法应用SPSS19.0统计软件包进行数据分析，计数资料比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 典型组和亚临床组感染HPV-DNA类型及感染情况比较亚临床组和典型组感染HPV-DNA亚型相比，差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1；不同组别低危型别和高危型别比较差异也均无统计学意义(P＞0.05)，见表2。感染类型相比，典型组尖锐湿疣单一感染率明显低于亚临床组，三重以及三重以上感染率明显高于亚临床组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，而双重感染两组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

表1 典型组和亚临床组感染HPV-DNA类型比较[例(%)]

表2 亚临床组和典型组尖锐湿疣低危及高危HPV型别比较[例(%)]

表3 亚临床组和典型组尖锐湿疣HPV感染类型比较[例(%)]

2.2 亚临床感染不同类型HPV出现顽固性复发情况比较所检出的108个HPV亚型中，复发次数高达3次以及3次以上的患者共14例，占13.0%，包括HPV16+18型4例、HPV16+52型3例、HPV16型3例、HPV18型2例、HPV6+11型1例、HPV43型1例。出现顽固性复发的HPV类型所占比例差异无统计学意义(χ2=3.521，P＞0.05)。

3 讨论

研究发现对人类有致病作用的HPV有40余种，不同的亚型导致患者出现症状不一。一般来说，尖锐湿疣引起患者感染多数为亚临床感染状态，多发生于外阴处。而当出现典型临床症状后，疣体可便发生于外阴和肛门任何地方。

在所有感染中，以HPV 6型和11型最为常见[5]。根据致癌的风险一般将其分为低危型和高危型。其中低危型主要包括HPV 6、11、40、42、43、44、55、61、81、83，其中以HPV 6、11最为常见，为尖锐湿疣的主要病原。高危型主要包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、26、53、68、82、73、53，其中以HPV16、18最为常见，其为宫颈癌发病的主要罹患因素[6]。国内同样有研究发现，低危型是目前国内主要的感染类型[7]。临床上治疗尖锐湿疣的方法较多，虽然在治疗当时效果明显，但是不少患者仍然会出现不同程度的复发情况，甚至复发三次及三次以上的顽固性复发，原因至今不明。有研究认为HPV复发与患者体内的性激素水平具有相关性[8]。但也有研究认为，复发和患者激素水平并无相关性，可能是由于HPV感染真皮层细胞所致[9]。杨庆永等[10]则认为，尖锐湿疣复发可能与亚临床感染具有一定的关系。

本研究择取的亚临床感染患者中，HPV 6型所占比例最高，为50.9%，HPV 11型和16型其次，分别占16.7%和13.0%。说明亚临床感染主要为HPV 6型，与相关研究一致。但本研究还发现HPV 56型感染有10例，而此类型以往鲜有相关报道。究竟此类型是否与尖锐湿疣亚临床期发生有关，目前并无相关报道，需进一步进行研究。本研究同样发现，在HPV亚临床感染患者中，低危型占79.6%，是主要的感染危型。并且其占比例与典型HPV感染差异无统计学意义，说明HPV感染均以低危型感染为主。本研究对顽固性复发的HPV亚型进行统计发现，HPV16和18型是最常见的复发类型，而这两者为高危型，提示高危型是影响患者预后的因素，但如要进一步了解是否具有相关性则需要通过对更大样本的研究。

综上所述，尖锐湿疣亚临床感染主要亚型为HPV 6型，并以单一感染为主，多种感染者复发率较高，应该引起临床重视。

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