PCR技术在猪肉中微生物检测的应用

文 昕，韩国全，王成程

（四川农业大学食品学院，四川雅安625000）

“国以民为本，民以食为天，食以安为先”，食品安全直接关系到一个国家的人民身体健康、经济有序发展、社会和谐稳定，是头等大事。因此，保障食品安全既是国家政府的基本职能和重要工作，也是全社会、全人类的共同责任。我国是全球猪肉消费最大国，猪肉作为我国居民最主要的副食品，其消费长期占肉类消费比重的60%以上，可谓是大众消费的主力军。但是，近年来关于猪肉的食品安全事件却屡见不鲜。有数据显示[1]：2005年～2014年间，我国各省（自治区、直辖市）发生的猪肉食品安全事件数总计为774件，其中52%的食品安全事件源于化学性风险（如违规使用瘦肉精、二恶英、沙丁胺醇等化学品），40%源于物理性风险（如肉中混入外来污染物等），近10%是由微生物风险因素引起的。然而，根据世界卫生组织估计,全世界每年的食源性疾病患者中，70%都是由致病微生物引起的。可见，从全球范围来看，微生物是引发疾病的根源，这就对我国猪肉流入市场之前的致病微生物检测提出了更高要求，应当从源头上保证猪肉的质量安全，从而防止食品安全事件大面积爆发。

目前，应用于生猪肉中微生物检测的主要技术有：免疫学技术、PCR技术、DNA探针法、基因芯片技术等。由于传统微生物检测方法存在检测成本高、速度慢、效率低的缺陷，因此难以满足不断发展的检测要求。PCR技术以其特异性强、快速简便和灵敏度高等优点成为最常用的检验方法之一。

1 PCR的发展历程

1.1 第一代PCR

多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外快速扩增DNA的方法。自1985年建立以来，PCR已成为许多科学研究、临床和法医研究中不可或缺的技术。常规PCR技术采用琼脂糖凝胶电泳的方法来对PCR产物进行分析，其扩增过程包括以下3个步骤：DNA分子变性、人工合成引物与变性单链DNA退火及碱基扩增。传统PCR技术相对于选择性培养、单克隆挑选等方法而言，选择性更强、灵敏度更高。但这一方法容易因引物设计的缺陷或检测品中的某些物质抑制PCR反应而出现假阳性，因此主要适用于定性和半定量的食源性微生物研究。

1.2 第二代PCR

十几年来，PCR技术从定性到定量，经历了实质性地发展变革。第二代PCR技术包括反转录PCR、多重PCR、巢式PCR、免疫PCR、实时荧光定量PCR等。其中实时荧光定量PCR（fluorescent quantitative real-time PCR）是近年来研发的新技术，能准确地量化给定样本中的目标DNA。该技术以荧光共振能量转移原理为基础，在PCR反应中加入荧光分子作为标记，由于荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA产量成正比，利用已知起始拷贝数的标准品做出标准曲线，即可对荧光信号进行“实时”检测，计算出样品起始拷贝数。相较于常规PCR检测技术，荧光定量PCR检测技术有了进一步的创新和改进，一般有染料法和探针法。探针法中基于TaqManTM技术具有一定的优势，具有高灵敏度、高特异性和再现性，已被广泛用于致病生物检测、癌症研究、基因表达及多态性研究。但是，正因为其高特异性，导致只适用于一个特定的目标且价格较为昂贵。

1.3 第三代PCR

随着科研需求的不断提高，定量PCR技术也存在多种因素对DNA的扩增过程造成影响，循环阈值（Ct）不能保证恒定不变，也只能是“相对定量”。此时，能够进行“绝对定量”的新技术——数字PCR（digital PCR，dPCR）应运而生。数字PCR是通过将一定限度的稀释样品分布到成千上万的反应单元中进行微反应，并使每个反应单元存在一个或多个拷贝的目标分子。通过PCR扩增和荧光信号分析，再利用泊松统计分布的阳性计数，得到样品中的DNA分子密度[2]。数字PCR主要包括 3大类，即微反应室 /孔板（Micro．chamber）、微流控芯片（Microfluidicchip）和微滴PCR系统（droplet digital PCRsystem，ddPCR）。数字PCR已被广泛应用于突变检测、拷贝数变异分析、产前诊断、转基因食品检测。其缺点有：一是由于系统开放，通过扩增的PCR产物有可能污染环境；二是由于其是一个手动系统，因此相当耗费人力。

2 PCR技术在猪肉中微生物检测的研究进展

2.1 PCR技术检测猪肉中沙门氏菌

沙门氏菌是一种全球性食源性病原体，大约占美国食源性疾病暴发的30%，占欧盟的23%，我国内陆地区食源性疾病爆发也以沙门氏菌引发为首。猪肉是人类沙门氏菌病的重要来源，因此快速检测猪肉中沙门氏菌有利于防止沙门氏菌食物中毒。在国内研究者中，姚大伟[3]等人根据沙门氏菌ttrBCA基因设计引物和探针，建立了含扩增内标的生鲜猪肉中沙门氏菌Real-time PCR检测方法，该方法能在12h内对人工污染沙门氏菌的猪肉样品做出检测，并且可以避免假阳性现象的产生。王静[4]等人经过试验发现，在0．1%脱氧胆酸钠（SD）和 40μg/ml PMA的协同作用下，可以有效抑制 108cfu/mL的沙门氏菌死菌DNA进行PCR扩增，而不抑制活菌DNA扩增。这种结合叠氮溴化丙锭(PMA)与微滴数字PCR（ddPCR）的技术，可以专门对猪肉中的沙门氏菌活菌进行检测。在国外研究学者中，Caterina Agrimonti[5]等人利用实时定量PCR（qtPCR）技术，加入SYBR GreenER来定量检测猪肉中沙门氏菌，检出限达102cfus/ml。

2.2 PCR技术检测猪肉中大肠杆菌O157:H7

肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC）是能引起人出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌。主要菌型大肠杆菌O157:H7是一种新型肠道致病菌，是全球公认的重要致病菌和人兽共患病病原微生物，以牛、羊、猪等家畜为主要宿主。在国内研究者中，夏灿[6]等人根据GenBank公布的大肠杆菌O157：H7的菌体抗原基因rfbE、鞭毛抗原基因fliC、溶血素基因hlyA、紧密黏附素基因eaeA和志贺样毒素基因stxl和stx2的序列，分别设计6对特异性的引物及相应的Taqman探针，建立快速、特异性地检测大肠杆菌O157：H7及其4个主要毒力基因的三重荧光定量PCR方法。在国外研究者中，Sher Bahadar Khan[7]等人对325份肌肉和组织及猪场样本使用MPN-PCR方法，以flicH7和rfbO157为目的基因，检测了其中O157:H7大肠杆菌的含量并进行菌株分离和毒力实验。

2.3 PCR技术检测猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes,以下简称单增李氏菌）是一种能引起人畜共患的食源性致病菌，广泛分布于土壤、污水、人和动物的粪便、饲料及多种食品中。单增李氏菌有严重的致病性,可以引发脑膜炎、孕妇流产、败血症及食物中毒。由于该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，因此是未杀菌的冷藏食品主要病原菌。在国内研究者中，李丹丹[8]以iap基因为靶基因，设计合成引物及TaqMan探针，建立实时荧光定量PCR快速检测方法。灵敏度为6．5cfu/mL。李慧[9]选取hlyA基因为靶基因，利用荧光定量PCR与锁定寡核苷酸（LNA）相结合的方法，对比三种从猪肉中提取单增李氏菌的方法，优化后最终纯菌培养物检测灵敏度可以达到30 copies/μL，1．2×10 cfu/mL；人工污染猪肉检出限可以达到48 copies/μL，3．2×102cfu/mL。在国外研究者中，Keping Ye[10]等人采用RT-PCR法检测冷冻猪肉中单增李氏菌，不需要预富集步骤，在与肉类相关的其他41种菌株中均无扩增信号，特异性良好。在纯培养和人工污染冷冻猪肉样品中，检测限为100 cfu/mL。

2.4 PCR技术检测猪肉中金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌隶属于葡萄球菌属，是革兰氏阳性菌的代表。它是引起人、动物化脓感染的重要致病菌，产生的肠毒素容易造成人食物中毒，因为产生的肠毒素有极高的热稳定性，100℃下30 min不会失活，因此食品一旦被污染，即使经过高温烹煮仍然可能致病。据报道，在对市场进行随机抽样检测中发现，生肉类的金黄色葡萄球菌检出率高达18．5%，早年间该数值甚至更高。这暴露出在肉类食品加工、贮藏、运输到销售的各个环节都存在漏洞，应当引起监管部门的高度重视。在国内研究者中，李苗云[11]等人以金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因（nuc）为靶基因，结合BP平板计数法建立20℃条件生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR检测方法。实验结果表明，进入稳定期后，荧光定量PCR检测结果高于传统平板计数。在国外研究者中，Viktoria Atanassova[12]等人在135个生猪肉样本中，通过RFLP-PCR检测出62．2%的样品感染金黄色葡萄球菌，而使用传统的PCR方法检测的结果只有57．7%。ZP Guan[13]等人通过设计5对特异性引物来鉴定猪肉中沙门氏菌（invA基因），单核细胞增生李斯特菌（hlyA基因），大肠杆菌 O157：H7（rfbE基因），金黄色葡萄球菌（nuc基因）和小肠结肠炎菌（ail基因），建立并优化多重PCR体系。实验结果表明，过夜培养后，同时检测5种目标病原体的检测限为103cfu/mL，检测单一病原体的检测限小于10 cfu/mL，其中检测金黄色葡萄球菌的检测水平为51 cfu/mL。

3 结语

目前，PCR技术已经在转基因成分、动物源性成分和食源性致病微生物的定量检测中得到了广泛的应用,但在食源性致病微生物方面还应该有更好的发展。随着该技术的推广与应用，一方面缩短了检测时间，提高检测效率,提升食品安全卫生的检测水平；另一方面为食品安全风险预警系统的建立奠定了基础,为人们的健康生活保驾护航。

但就应用现状而言，单纯PCR技术仍存在一些缺陷：如若病原微生物具有高度变异性，则容易出现假阳性结果；不能检测扩增产物的大小、每位研究者用于生成标准曲线的样品不同，没有参考的意义等。今后改进的方向可以从实验的各个阶段入手：例如在前处理阶段，综合应用冻融、超声、摇床、匀浆、PMA等技术；在DNA提取阶段，可以结合DNA提取试剂盒、TZ裂解液提取法、SDS高盐提取法、FTA滤膜等方法；样品的分离纯化阶段，可以结合免疫磁珠分离技术等；在微生物检测阶段，可以结合LAMP技术、比较应用染料法或探针法等。PCR技术的应用范围也可以从猪肉中微生物定性和定量检测、肉源性成分的确定以及新鲜度指标的应用拓展到食品安全的更多领域。