分子育种技术在肉牛繁育中的应用与研究进展

丁丽艳 韩永胜 李同豹 丁得利 李平

（黑龙江省畜牧研究所 161005）

自二十世纪八十年代以来，随着信息技术和分子生物技术的迅猛发展，动物分子育种技术的研究取得了一系列突破性的进展，动物育种技术已逐渐从宏观的群体水平进入微观的分子水平，随着动物分子育种理论基础不断完善，应用技术不断成熟，各种现代生物技术的综合应用，肉牛分子育种工作取得了突飞猛进的发展。

1 分子育种技术在肉牛品种间亲缘关系诊断的应用

应用动物分子诊断技术能够检测各品种牛间的亲缘关系的远近。Kierstein等[1]应用线粒体分析不同来源水牛品种mtDNA D-loop序列发现，128个多态位点和36个mtDNA单倍体，分析表明，沼泽型水牛和河流型水牛驯化地点都可能是亚洲次大陆。Tu等[2]用分子诊断技术分析了牦牛mtDNA多态性发现，牦牛与普通牛多态性区别明显，依此估测到牦牛和普通牛祖先分化时间大约相差十万年。宁素恒[3]分析牛乳铁蛋白基因 (LF)同源进化关系牛LF基因与马的亲缘关系最近。孟彦[4]采用SSCP方法对11个中国地方黄牛个体线粒体DNA D-loop序列和12S rRNA基因的多态性研究表明，日本黑牛、安格斯牛和海福特牛亲缘关系较近，而西门塔尔牛、蒙古牛、延边牛亲缘关系较近。

2 分子育种技术在肉牛生长发育相关性状基因诊断的应用

肉牛的生长发育候选基因的研究涉及肉牛的体重、体高、体长、十字部高、腰角宽和日增重等，主要包含ACAN、POU1F1、LPL、GH、IGF、DGAT2等基因。

ACAN是核心蛋白聚糖的一种，是牛矮小症状的主要候选基因。Cavanagh等[5]发现，携带ACAN基因的牛在生长过程中表现侏儒症。POU1F1基因在牛胚胎分化和生长发育过程中具有重要的作用，通过促进GH、PRL和TSHβ及自身基因的转录来实现对牛生长发育等性状的调控，促进相关基因细胞系的生长和发育[6]。刘波等[7]通过试验发现，POU1F1-E6H基因座与秦川牛的体重、体尺等生长性状之间存在相关性，胸围、十字部高指标相比，AB和BB基因型个体显著高于AA型个体，且相关基因与育肥性状关系较大。LPL是一种脂肪分解酶，在脂蛋白中的载脂蛋白C2的辅助和催化下，LPL在脂类代谢和运输中发挥着重要作用。邱国宇[8]利用秦川牛和南阳牛为研究对象，研究LPL基因多态性与牛生长发育性状的关系发现，秦川牛杂合子 （AB）型基因，在体重、体高、十字部高、体斜长、胸围和尻长指标上显著高于纯合子 （AA和BB），而南阳牛杂合子 （AB）个体在初生重指标上显著高于纯合子（AA、 BB） 个体。

GH是由脑垂体前叶细胞分泌的一种单一肽链的生长激素，它能调节牛的所有组织和细胞的生理功能，控制着牛的生长激素分泌水平和生长发育。高雪等[9]对GH基因研究表明，GHP3即第5外显子2141 bp处和3'的GH-P4位点显著影响牛的体重、体高、体斜长、胸围和肉用指数。IGF是一种生长激素依赖性多肽，它可以促进蛋白同化和有丝分裂作用，调节细胞增生及分化，IGF有IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ两种类型。IGF-Ⅱ调节胚胎时期的发育，IGF-Ⅰ则调节出生后的个体生长和发育。DGAT2是合成甘油三酸酯过程中的关键酶，在脂肪代谢、脂类在组织中的沉积、肠道脂肪的吸收中发挥重要作用。张争锋等[10]研究南阳牛DGAT2基因第6内含子多态性与体重、体尺性状的关系，结果表明2岁体重、6月龄体高、6月龄到2岁的胸围和体斜长相比，AA基因型南阳牛个体显著地高于杂合基因型AB。

3 分子育种技术在肉牛胴体和肉质相关性状基因诊断的应用

随着生活水平的提高，人们对肉质的要求越来越高，对肉质性状基因的研究成为肉牛育种工作中的一个重点。主要衡量指标有胴体重、大理石花纹等级、眼肌面积、背膘厚度、瘦肉率、嫩度、肌肉酸碱度、肌肉剪切力等，主要相关基因有MSTN、 calpains、 FABPs、 MyoD1、 PRKAG3、 DHCR24、 CS、PPP1CB等。

MSTN基因突变可使牛出现双肌性状，在同一饲养条件下，双肌牛产肉性能是普通牛的1.3倍，且骨骼较细，肌肉发达、瘦肉率高、肉质细嫩。王娇娇[11]以辽育白牛为研究对象，对MSTN基因进行分析表明辽育白牛MSTN基因在不同组织中具有表达差异性，其中肌肉中表达量最高。钙激活蛋白酶（calpains)是含巯基的蛋白酶，主要位于肌纤维附近和肌质网膜上，在动物屠宰后的肉成熟过程中起着着色的作用，μcalpaind能分解肌肉细胞中的蛋白质，使肌肉在此过程中达到嫩化作用。脂肪酸结合蛋白 （FABPS）在脂肪酸生成过程中参与细胞内脂肪酸的运输，加强脂肪酸的转运扩散，参与细胞内脂肪酸的摄取，促进细胞膜吸附脂肪酸，调整细胞内脂肪酸的浓度[12]。

MyoD1基因参与动物体多种分化细胞转化为肌细胞的生产过程，是骨骼生长和再生过程的一个转化因子，影响肌肉组织结构的表达。黄萌等[13]以秦川牛、鲁西牛和西门塔尔牛为研究对象，利用PCR-RFLP法分析MyoD1基因多态性与相应牛个体的胴体性状关联性，结果表明，MyoD1基因C1867T位点对肉牛的背膘厚、大腿肉厚度的影响差异极显著。PRKAG3是蛋白激酶 （AMPK）的r3亚基构成的三聚体，具有肌肉特异表达的特性，通过对7个品种牛的PRKAG3基因多态性研究发现第4内含子存在两处突变，且不同基因型对应的嫩度性状差异显著，同时也影响牛肉的pH和色泽[14]。

尹璐[15]以中国西门塔尔牛为研究对象，利用PCR-RFLP法分析DHCR24基因的多态性，通过对445头牛进行基因型检测，分析与肉质和胴体性状的相关性。试验结果表明，多种肉质和胴体性状在DHCR24基因外显子9的不同基因型之间有显著差异，杂合子GA基因型个体与大理石花纹、后蹄重和脂肪颜色性状具有显著相关性；纯合子GG基因型个体与背膘厚、大腿肉厚、后腿围、眼肌面积和腰部肉厚性状具有显著相关性。田静[16]用95头西门塔尔牛为试验材料，以CS（柠檬酸合成酶基因）为候选基因，采用PCR-RFLP的方法分析基因外显子3的遗传多态性与西门塔尔牛肉质性状的相关性，结果表明，CS基因第三外显子第206bp处存在G/A突变，该基因多态性与脂肪颜色呈显著相关，AA型显著高于BB型，对其他性状的影响差异不显著。姜颖[17]研究PPP1CB基因与肉质相关性分析表明，PPP1CB基因第一内含子第14 434bp碱基处存在C/T基因突变，该基因多态性与屠宰率也呈显著相关，对其他性状的影响差异不显著。

4 分子育种技术在肉牛繁殖相关性状基因中诊断的应用

繁殖性状是牛育种中一个重要的性状，繁殖性能的高低直接影响养殖业的经济效益。繁殖性状涉及牛的双胎性能，一般自然状态下，牛为单胎动物，双胎率只有0.15%左右。牛的繁殖性状候选基因主要包括FSHR、LH、GDF9、RXRG、GnRH等。

FSHR为促卵泡激素受体基因，是G蛋白耦合受体。雷雪芹等[18]以秦川牛单、双胎母牛为对象研究FSHR基因的多态性，结果双胎母牛的双胎牛和单胎牛之间FSHR基因的第10个外显子的突变率差异显著。魏伍川等[19]也研究表明，FSHR基因与牛的繁殖性状存在连锁相关。LH是促黄体素基因，与促卵泡激素FSH协同促进卵泡生长成熟，参与内膜细胞合成雌激素，诱发动物排卵，促进黄体生成，LH由α和β两个亚基因构成。刘继丰等[20]发现，LHβ不同基因型西门塔尔牛和夏洛牛的冻精畸形率和射精量显著不同，这表明LHβ基因是影响精液品质的一个主效基因。GDF9即生长分化因子9基因，是卵母细胞分泌的生长因子，调节卵巢卵泡的生长和分化，对动物繁殖起着重要作用。张路培等[21]以鲁西黄牛为研究对象发现，在GDF9的3'UTR缺失突变，且双胎牛的B等位基因频率显著高于单胎牛。

RXRG即视黄酸X受体γ基基因，参与上皮细胞生长、细胞分化、胎儿发育等作用。RXRG基因定位于牛的3号染色体上，在肌肉中完全表达。黄萌等[22]研究发现，不同基因型鲁西单、双胎牛RXRG基因位于3'UTR多态位点差异极显著，这表明RXRG基因与鲁西牛双胎性状具有密切相关性。于影等[23]报道GnRH即促性腺激素释放激素，与特异性受体 （GnRHR）结合后，通过调节LH和FSH的水平来刺激性激素的产生、卵泡和精子的发育，从而调控卵巢和睾丸的功能，因此在繁殖中起到重要作用，外源GnRH可以促进具有繁殖障碍母牛的妊娠。

5 结语

虽然分子育种技术在牛的品种间亲缘关系的诊断，生长发育、胴体和肉质、繁殖性状相关基因的诊断方面取得了一定的进展，但分子育种技术的研究还不够完善，许多功能基因的研究只限于局部的某一片段，还缺少该功能基因的全部基因序列的研究，且不能作为独立的育种技术进行应用。但随着分子生物技术的不断提高，研究的不断深入，分子育种技术基础将会越来越完善，应用条件将日臻成熟，分子育种技术必将在肉牛育种中广泛应用，在育种中发挥出重要作用。