山羊MSTN基因研究及其在甘肃本地山羊的应用

杨军祥

（甘肃省畜牧兽医研究所 744000）

转化生长因子β(transforming growthfactor-β，TGF-β)超家族成员广泛分布于脊椎动物体内[1]，在调节骨骼肌发育和维持机体稳态方面发挥重要的作用，该家族成员主要包括TGF-β抑制素、TGF-β活化素等。

肌肉生长抑制素 （myostatin，MSTN）在1997年被美国科学家McPherron首次发现，属于生长分化因子β超家族成员。MSTN是近年来发现具有负向调控作用的因子，该基因的突变可使MSTN活性降低或者丧失，从而促使骨骼肌更好地生长发育，出现 “双肌臀”。目前，研究人员已经根据该基因培育出了经济效益佳的肉畜品种，如作为终端父本的 “双肌臀”肉牛，在生产中产生了巨大的经济效益，具有瘦肉率高、饲料报酬好和生长速度快等特点。

中国是世界上山羊存栏量最多的国家，也是世界上最大羊肉生产国。山羊以天然草料为主食，其肉质好、蛋白含量丰富、能量低，富含多种氨基酸和微量元素，且胆固醇含量低。畜产品瘦肉率的提高和肉品质的改善有利于优化人们的膳食结构，寻找与畜禽生长性状和肉质性状相关的候选基因或遗传标记，对品种改良具有重要意义。本文从山羊MSTN基因的结构、生物学特性、功能及作用机制等方面的研究进展入手，探寻MSTN基因与山羊生长性能及经济性状的关系，为甘肃本地山羊种质资源保护、开发和利用开辟新的途径。

1 MSTN基因的结构

MSTN基因的cDNA（complementary DNA）是由1个可读框和能编码376个氨基酸的脱氧核糖核苷酸碱基序列构成，其中外显子3个、内含子2个，而成熟区是其第3外显子。MSTN基因具有TGF-β超家族成员的典型结构特征，即由52ku的前体蛋白质N-末端区和编码12.5ku成熟肽的C-末端区构成[2]，在N-末端区与C-末端区之间存在1个蛋白酶解加工位点，经过2次蛋白酶解加工，除去信号多肽，切除前体蛋白质生成N-端前肽与C-端多肽，而C-端多肽又以—S—S—(二硫键)键相连形成二聚体，构成MSTN成熟蛋白分泌至血液循环，并与N-端前肽以非共价键形式形成LAP。

除以上所述之外，MSTN基因与TGF-β超家族成员还有下面4个共同点：（1）在信号肽的N-末端区附近有一个氨基酸残基构成的疏水前体蛋白质核心； （2）MSTN蛋白质靠C-末端区的中间部位有一个保守的蛋白酶解加工信号 （RSSR，263-266位氨基酸）； （3）9个半胱氨酸残基在C-末端区形成 “Cys Knot”结构； （4）分子之间的二硫键均能聚合形成二聚体，并和细胞膜上的受体结合，通过3种Sand蛋白介导，将信号传入细胞，作用于靶基因的调控区。

Thomas等利用MSTN特异性抗体，在牛成肌细胞培养物的提取液中检测到52ku的前体蛋白质、40ku的LAP，但没有检测到加工后的活性蛋白，这可能是因为成熟的活性蛋白被分泌到血液的缘故[3]。但在骨骼肌提取物中检测到26ku的活性蛋白。而McPherron等则报道在CHO细胞表达的重组MSTN前体蛋白和成熟的活性蛋白分别为52和12ku，这种分子质量的差异可能是由于翻译后修饰造成的[2]。

Gonzalez-Cadavid等证实，人的MSTN基因也由3个外显子和2个内含子组成，位于染色体2q33.2，含有3个转录起始位点，转录产物为3.1kb的mRNA，编码375个氨基酸的前体蛋白[4]。Ma等克隆了人MSTN基因包括5′端调控区在内的全长3.3kb片段，结果发现，MSTN启动子序列含有对多种物质的生长反应元件，这些物质包括糖皮质激素、肌生长分化因子1、肌细胞增强因子2、核因子-B等，并发现在体外，地塞米松以一种剂量依赖的方式不仅可增强MSTN启动子的转录活性且可增强内源性MSTN基因的表达[5]。

2 MSTN基因的生物学功能

MSTN基因的功能主要体现在抑制肌肉增肌和脂肪积累两个方面，其具体的生物学功能包括以下几个方面。

（1）MSTN基因对肌肉的生长起负向调控作用即抑制肌肉生长。Mcpherron利用基因敲除技术证明了MSTN基因突变后的小鼠肌肉重量增大[2]。目前已有学者研究证实，牛MSTN基因可以改变肌肉的组织构造，把MSTN基因钝化，使骨骼和皮下脂肪间的肌肉相互抑制作用减弱 (即骨骼肌的激增)，因为未成熟的终止密码子和蛋白的无功能表达引起1个多肽的平截，使MSTN基因不能被表达为功能蛋白质，从而出现臀部、胸及其中前端肌肉异常发达，且皮肤较薄的 “双肌臀现象”。

（2）MSTN基因与肌肉再生有一定的关系。Wagner等利用MSTN基因完全突变的小鼠与肌肉萎缩型小鼠杂交发现，MSTN基因完全缺失的肌肉萎缩型小鼠与非缺失的萎缩性小相比更为强壮、肌肉更多，肌肉间的隔膜表现出更少的纤维样变形，这表明MSTN基因缺失对肌肉再生有促进作用[6]。Taylor等用重组MSTN基因对鼠骨骼肌C2C12细胞进行检测，结果表明，重组MSTN蛋白在C2C12肌细胞中能抑制或阻碍细胞的增生、DNA合成和蛋白质合成，证明MSTN基因可能通过抑制肌肉的再生控制肌肉的生长[7]。

（3）MSTN基因能使肌肉萎缩。Gilson等通过研究人慢性废用性肌肉萎缩中MSTN基因mRNA的表达水平发现，大多数病人的MSTN基因mRNA表达水平比正常人显著高，同时其表达量与2A、2B型纤维量成反比，因此，得出MSTN基因是促使肌肉萎缩的因子[8]。

（4）MSTN基因抑制脂肪沉积。Zimmers等研究发现，给裸鼠腿部注射能稳定表达MSTN的CHO细胞后，裸鼠全身骨骼肌出现萎缩现象，体内的白色脂肪也差不多完全消失，说明MSTN基因不仅能抑制肌肉的生长，还能参于体内脂肪的代谢，抑制脂肪积累，这在生产中有利于提高瘦肉率[9]。

3 MSTN基因多态性的研究进展

目前的研究结果表明，MSTN基因的功能在不同动物间高度保守。Lee将小鼠MSTN的保守C-末端编码序列作为探针，对小鼠、大鼠、人、牛、猪、羊、鸡、火鸡、斑马鱼的MSTN cDNA进行克隆、测序，研究发现，各种动物的MSTN基因序列高度保守，其N-末端都有分泌必需的信号肽序列，都有类胰蛋白酶作用水解加工位点 (RSRR)，都含有TGF-β超家族的富含半胱氨酸的保守区，且小鼠、大鼠、人、猪、鸡、火鸡的水解加工位点后的C-末端序列完全一致，同源性为100%，而牛、绵羊的成熟蛋白中也仅有l～3个。

刘铮铸等采用限制性内切酸酶Mnl I对山羊MSTN基因的379bp的扩增产物进行PCR-SSCP多态性分析，证实山羊内含子2、外显子3区域存在多态性[10]。孟详人等利用PCR-RFLP技术对11个绵羊品种MSTN基因非编码区进行多态性分析，发现存在3种基因型CC型、CT型和TT型，且3种基因型在11个绵羊品种中的分布差异极显著 （＜0.01）[11]。刘铮铸等采用PCR和直接测序的方法对我国9个地方绵羊品种和1个引入品种共计60个个体进行MSTN基因内含子2和外显子3的多态性检测及单倍型分析，共发现15SNPs，全部存在于内含子2中，同时检测到12种单倍型，并推测单倍型VIII可能与绵羊的产肉性能有关[12]。朱红刚等采用PCR-RFLP方法对67只贵州小香羊MSTN基因内含子2和外显子3进行了多态性分析[13]。结果表明，所扩增内含子2中存在Bsp1286I的酶切多态位点，共检测到3种基因型AA型、AB型、BB型，其中AB为优势基因型；所扩增内含子2和外显子3中存在BstBI酶切多态位点，杂合型 （CD）为优势基因型，纯合野生型 （CC）和纯合突变型 （DD）为非优势基因型，D等位基因为优势基因。

由此可见，山羊的MSTN基因与其他动物MSTN基因相似，具有一定程度的保守型，其多态性主要集中在内含子2和外显子3区域，该基因对于家畜肌肉的生长影响较大。

4 MSTN基因调控机制的研究

MSTN基因对肌肉生长负调控的作用机制至今尚未完全清楚，目前的研究结果认为，其作用机制有以下途径。

根据TGF-β超家族成员信号传导途径，推测MSTN基因抑制肌肉生长的作用机理：MSTN基因在信号转导过程中需要Ⅰ型 （TβRⅠ）和Ⅱ型 （TβRⅡ）受体的异二聚体复合物。MSTN基因C-端的半胱氨酸二聚体首先与TβRⅡ型受体结合，然后再与TβRⅠ型受体结合，于细胞表面处形成异源聚合体，通过TβRⅡ型受体激酶的活性，导致TβRⅠ型受体CT区域发生磷酸化，活化的TβRⅠ型受体可暂时与胞浆内Smads家族中的Smad2、Smad3结合，并激活C-端SSXS区域使丝氨酸残基发生磷酸化。最后与无磷酸位点Smads家族中的Smad4形成异源聚合物，进入细胞核中，导致生肌调节因子MyoD磷酸化过程受阻，阻止了与E-box位点的结合，这个E-box位点是其碱性区域和位于成肌细胞调控区内肌动蛋白启动子的转录因子的结合位点，干扰有活性MyoD-E-box形成特定的肌肉蛋白质，从而抑制成肌细胞向肌细胞分化，阻碍肌肉的形成。

5 MSTN基因在甘肃本地山羊种质资源保护和开发利用上的前景

陇东黑山羊是甘肃省优良的地方山羊品种，具有抗逆性强（耐寒、耐旱），肉质优良 （羊肉鲜嫩，膻味轻，口感佳），适应性好 （耐粗放管理、耐粗饲）等优点。陇东白绒山羊是以陇东黑山羊为母本，引进辽宁绒山羊和内蒙古白绒山羊做父本，经过长期的杂交选择培育而成的以绒用为主的山羊品种。近年来，由于盲目引种和放任本交，使得陇东黑山羊和陇东白绒山羊的血统混杂、生产性能严重退化，纯种饲养量下降，甚至处于濒危状态，种质资源保护迫在眉睫。为了保护、开发、利用这些优良的地方品种，基层畜牧工作者和科研人员进行不懈的努力，随着现代生物技术的普及、地方畜牧从业者理论技术的提升和基础条件的改善，利用分子标记技术进行优势基因发掘和种质资源保护也提上了日程。

MSTN基因是调控肌肉生长发育的重要功能基因，也是重要经济性状的候选基因，具有广阔的应用前景，其多态性与生产性能的关系等已成为当前的研究热点。因此，在陇东黑山羊和陇东白绒山羊种质资源保护、开发、利用上，可以利用分子标记辅助选择技术，研究其纯种个体及其与布尔山羊等优秀肉用山羊杂交后代MSTN基因的多态性和生长发育、产肉性能之间的关系，分析其群体遗传结构，并确定其对羔羊体重、体尺及屠宰性能的影响，确定最佳杂交改良方案。同时，筛选出MSTN基因突变的个体，通过培育选择出产肉率高、肉品质好和饲料报酬率高的优秀个体作为种畜进行推广，深度发掘地方优良品种潜力，为陇东黑山羊和陇东白绒山羊种质资源保护、开发、利用工作开辟新的途径。