幽门螺杆菌体外培养技术的研究进展

陈 彬 詹 学

重庆医科大学附属儿童医院消化内科，重庆 400014

早在十九世纪中晚期，德国科学家在观察人体胃组织切片的过程中就发现了螺旋菌，即后来的幽门螺杆菌（helicobacter pylori，HP），因无法体外培养，它一直没有受到人们的重视，直到1982年才被两位澳大利亚科学家巴里·马歇尔（Barry J.Marshall）和罗宾·沃伦（J. Robin Warren）首次成功在体外分离培养。由于它与胃炎、胃溃疡和胃癌的密切关系[1]，人们越来越需要对HP的生物特性进行研究，从而指导临床诊疗工作，那么，如何改进已有的培养方式，使得HP的体外培养更加方便、快捷、高效就成为了一个亟需解决的问题，所以，从那以后人们一直在不断探索HP的最优体外培养条件。至今，各种体外培养方法已经得到了不同程度的优化。几个关键的培养条件为全血或血清、微氧及适宜的CO2气体环境，高湿度，温度37℃，pH值7.5以及4～10d的发酵周期[2]。

1 固体培养基

1.1 菌株的制备和保存

目前培养用的幽门螺杆菌的来源主要有两个：一是在非选择性培养基上，通过病理活检组织培养获得HP。常用的非选择性培养基常为脑心浸液琼脂，其组成为：脑心浸润液，琼脂，5%脱纤维羊或牛血清。这种方式优点是成本低且易操作；缺点：一是得到的菌株可能不纯，且由于培养条件的限制，每次得到的菌株数量有限。同时，有报道称实验室用布鲁氏肉汤培养基对HP感染患者的血清培养获得了较好的HP菌株[3]。二是直接向生物公司购买，这种方式优点是方便、快捷，而且得到的菌株较纯，缺点是成本高，大量需要菌株时不宜采用。

当用上述方式成功由活检组织中分离得到HP菌液后，我们需要将其进行保存，常用冷冻保存法，综合众多文献报道，保存效果及解冻后HP复苏率最高的为脑心浸液加甘油制成的冷冻保存液，保存温度为-70℃。而其它保存方法，如冻干保存法和布氏肉汤保存法，前者HP菌体复苏率极低，后者随着保存时间的延长，菌株数量不断减少。

1.2 培养基类型

当由人体胃组织样本获得的HP复苏后，可以通过多种方式进行体外繁殖培养。常用的培养基包括：布氏琼脂、哥伦比亚琼脂、脑心浸液琼脂和胰蛋白酶大豆琼脂。在前述培养基基础上添加羊或马血清（5%～10%）[2]。血制品也可以用高脂牛血清蛋白（AlbuMAX II）等代替[4]。另外，胰蛋白酶大豆琼脂可以不添加血清，作为HP的无血清培养基。需要说明的是，上述培养基中无论是加入血清还是全血，最终的培养结果并没有明显的差别，之所以建议加入血清，是因为加入全血的培养基，其颜色会越来越深，从而影响观察菌株生长情况。

1.3 培养条件

HP体外培养的气体环境非常重要。首先，HP的生长需要充分的二氧化碳（5%～10%）[5-6]。原因是多方面的，如丙酮酸通过二氧化碳固定作用产生的产物可能为碳同化提供了途径[7]。同时，HP产生的碳酸酐酶具有催化CO2与HCO3-相互转化的作用。因此CO2可能在酸碱平衡调节中起作用[8]。其次，HP是一种对氧气非常敏感的微需氧微生物，因此，当对病理组织样本来源的HP进行培养时，微需氧环境尤为重要。从实验室获取的HP在从微需氧（＜5%）到充分有氧（21%）[5]，环境中均可以顺利生长。另有报道称HP的几个特性，如溶血素形成、甲硝唑耐药、铁氧还蛋白氧化还原酶（ferredoxin reductase，FDXR）活性以及降低上皮细胞可塑性等，可能也取决于培养HP所采用的是微需氧或是足量氧环境。所以，关于HP体外培养的气体环境原则是：低氧、高CO2。有学者在培养过程中采用气体条件为 85%N2、10%CO2、5%O2时菌体生长良好[9]。这一气体比例也在后续的大量培养实验中被采用，均取得了不错的培养效果，因此，可将该气体比例作为HP体外培养的最适气体环境。

培养液的pH值也是影响培养效果的一个重要因素。在上世纪末，曾有学者认为HP生长的最适pH为4～10[10]，该pH范围过大，而且经过多次试验证实该观点不可靠。后来，曾浩等学者经过多pH梯度的HP培养研究确定最适pH为7.5[11]。这一观点也得到了后续众多学者实验结果的证实。

HP培养的湿度要求越高越好，培养环境的湿度至少应当在90%以上。而关于HP的最适温度，有文献报道当培养温度控制在（37±3）℃时，HP均生长良好。但多数学者在进行HP体外培养时，选择了37℃，结果菌体也生长良好，因此，本文中HP最适生长温度取为37℃。

综上所述，HP体外培养的最优方案总结如下：首先选择前述任一种培养基，加热溶解，在温度降至40℃～50℃时加入胎牛或羊血清（亦可用脂牛血清蛋白代替）（5%～10%）。再加入配制好的1%的抗生素混合液（万古霉素6mg/L、两性霉素2mg/L及TMP 5mg/L）。调节pH为7.5，培养基凝固后，将活检组织经非选择性培养基培养而得到的HP菌液接种，置入含充足CO2的微需氧环境（5%O2、10%CO2、85%N2或其他不影响菌体生长的气体）培养罐或其它密闭装置中，在温度37℃，湿度90%～100%条件下培养72小时左右，即可出现HP菌落，取少量菌落行革兰染色或尿素酶实验鉴定是否培养成功。另有研究指出，如需要进行菌体的集中培养，运输条件为低于24℃，且在24小时内完成[12]。

2 液体培养基

2.1 培养基类型

当需要进行HP的体外大量繁殖培养时，最常用的液体培养物是含胎牛血清（5%～10%）的布氏肉汤培养基。而胎牛血清可由环糊精、活性炭或者淀粉代替[13]。动物血清提升HP增长率可能与红细胞有关系，但环糊精、活性炭或者淀粉提高HP生长率的具体机制目前尚不完全清楚，可能的原因是血清中含有相关的生长刺激因子，而环糊精、活性炭及淀粉可以吸附菌体生长过程中产生的脂肪酸或其它有毒代谢物[14-15]。目前，用含有培养液的发酵罐对HP进行大规模体外培养已经取得了成功。

2.2 培养条件

在一些实验中，用组成成分单一或成分明确的培养基取得的培养效果比前面提到的组成复杂而具体成分不明的培养基更好，而成分明确的培养基含有：多种盐分、嘌呤、维生素、氨基酸等。成分明确的培养基中可以添加牛血清蛋白或环糊精与胆固醇的混合物以加强菌体繁殖效果。使用成分明确的培养基帮助人们对HP培养的营养条件、生理学特性和代谢特点有了更深的了解，同时也促进了菌体胞外蛋白表达谱的研究[16-17]。

几乎所有的HP菌株生长均需要精氨酸、组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸和缬氨酸，这与人类所需的基本氨基酸类似，不同菌株对丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、脯氨酸和异亮氨酸的需求也有所不同，菌株生长所需的营养成分还包括：丙酮酸盐、维生素B1和次黄嘌呤。HP对氨基酸需求的不同与HP菌体对应的生物合成基因的缺失有关[18]。

同时，利用液体培养基进行HP培养时，通气装置需要严格消毒，防止污染，同时有学者研究证实向培养罐中加入前文所述的混合抗生素也是必须的[19]。

总体而言，HP的体外培养技术目前已经基本成熟，现有的培养方式基本可以满足日常的科研工作及生产需要，但是，关于HP的体外培养，仍然有问题需要进一步得到解决。

3 目前存在的问题

HP在体外的生长与在体内的生存环境生长之间有差别。HP在机体内生长所必须的细菌蛋白，在体外培养时却并非必不可少，如尿素酶（一种含镍金属酶），它对HP在胃内的生长是必须的[18，20]，但体外培养时，它并非必需物质。镍元素对体内生长的HP是必须的，但体外培养时它也并非必需。体外培养时，HP可以利用游离的铁元素，但在体内生长时，HP只能利用血红素、转铁蛋白及乳铁蛋白作为铁元素的来源。这说明，HP菌体在机体内、外生长的营养需求、营养获取方式和代谢特点可能不同，即是HP在机体内、外的生物特性或理化性质可能发生了改变，这就有可能使得我们的研究从一开始就出现偏差，最终的结果自然也不一定可靠。因此，要更好地认识和研究HP应该满足的最佳条件是：体外培养获得的HP与体内定植的HP菌体的生物学特性非常相似甚至是完全一样。这对HP的培养方式和培养条件又将是一个巨大的挑战。

那么为了使体外培养获得的HP在生物特性、理化性质等方面更加接近于机体内部的HP，甚至是完全与之相同，截至目前，广大学者已经利用不同的动物模型进行HP体外培养，涉及到的动物包括猫、狗、猕猴、大鼠和小鼠等。经过大量模型实验发现：由于动物模型内常驻菌群与人体相差较大，不能很好的模拟人类自然病变，同时，不同物种对HP反应差异较大，因此无法建立典型的病理及免疫反应模型[21-22]。除此之外，我们可以设想是否可以将离体的器官（如胃），制作为一个拟态系统，使之内部生长条件与实际机体内胃的环境及其相似，以这一拟态系统作为HP体外培养的培养基进行HP的培养，使获得的HP菌株无论是在生物学特性上（包括粘附致病能力，产生并释放毒素和相关致病蛋白的能力等），还是在理化性质上都与人体内部的HP基本一致甚至相同，截止目前，笔者尚未发现有关这方面的报道，但目前已经有学者将离体的老鼠胃作为模型，进行HP致癌机制的研究并取得了不错的效果[23]，相信未来这方面的技术难题终会被人们攻克。

目前，HP体外培养的条件已经成熟并在日常临床级科研工作中广泛应用，HP的培养已不再像以前一样困难重重，但是，关于HP培养仍然存在一些问题，比如体外培养得到的HP菌株与机体内部菌株的代谢特点、营养需求、营养获取方式仍有一定差别，这也需要我们研究出更先进的培养方式，使获得的菌株在生化特点、生物学特性等方面更加接近于人体内部菌株，更好的为相关科学研究服务。

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