HLA-B*1502表达与AEDs致敏相关性的临床研究

侯蕴祈， 石海琴， 杨红姬

在中国癫痫发病人数近千万，需要长期服用抗癫痫药物，包括新旧抗癫痫药物，临床上广泛应用于癫痫、神经痛、精神性疾病等方面，大部分为芳香族(aromatic antiepileptic drugs,AEDs)，该类药物因具有类似的化学结构并均携带苯环，最常见的不良反应是引起皮疹，目前多观点认为，AEDs在身体经酶代谢后与蛋白多肽形成半抗原复合物，诱发后来的过敏反应[1]。引发的过敏反应在不同人种、不同民族、地缘远近地区中也有所不同。这说明过敏反应可能与基因相关，有研究显示中国台湾和香港地区癫痫患者应用CBZ引致的SJS、TEN和HLA-B*1502有较强的相关性[2]。在中国汉族人群中，8%～15%或更多的人可能是HLA-B*1502阳性基因型[3]。目前该基因与所有的AEDs的相关性尚不确定，需要临床研究提供进一步的证据[4]。如能明确HLA-B*1502阳性基因型是AEDs致敏的必要条件，对指导临床用药有很大意义，本研究通过对AEDs致敏性和HLA-B*1502关系进行分析，探寻HLA-B*1502是否可以作为潜在的靶点蛋白，以求为患者预后的判断提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2014年1月1日-2017年6月31日我院门诊与住院部及广州医科大学附属二院神经科学研究所AEDs致敏性患者75例资料。均为AEDs诱导皮肤不良反应的患者，男性35例，女性40例，诊断为AEDs致敏性，平均年龄为(5.94±1.85)岁。病例随访中，最短的随访14个月，最长的58个月，中位随访时间为45个月，其中单药致敏组36例，男性18例，女性18例，平均年龄为(5.71±1.96)岁；多药致敏组39例，男性17例，女性22例，平均年龄为(5.99±1.85)岁；轻型药疹组40例，男性20例，女性20例，平均年龄为(5.75±1.85)岁；抗癫痫药物高敏综合征组35例，男性15例，女性20例，平均年龄为(5.98±1.75)岁；同时纳入健康对照组60例，男性31例，女性29例，平均年龄为(5.75±1.79)岁；组间年龄、性别无显著差异。

1.2 方法 RNA提取及RT-PCR反应：采集入组患者和正常志愿者静脉血，EDTA抗凝管收集后用德国QIAGEN公司DNA抽提试剂测定DNA纯度和浓度，调至30 μg/ml在-40 ℃保存。顺序特异性引物聚合酶链反应(sequence spcific primers，PCR-SSP):设计6对特异性引物(分别为S1、S2、S3、S4/s5、s6)及两对内参引物(C1、C2)。25 μl PCR反应体系：DNA50 ng，dNTPs 200 μmol/L，Taq聚合酶0.05 U/μl,各引物终浓度为1 μmol/L,反应缓冲液终浓度为1×PCP缓冲液。PCR反应：扩增热循环：96 ℃预变性60 s,96 ℃变性30 s,62 ℃退火30 s,2 ℃延伸45 s,4个循环，96 ℃变性10 s,58 ℃退火10 s,72 ℃延伸45 s,21个循环，96 ℃变性10 s,55 ℃退火50 s,72 ℃延伸90 s,9个循环。 2.0%凝胶电泳检测，凝胶成像系统荧光成像。

1.3 统计学方法 本研究统计学数据采用SPSS 18.0进行统计分析，精确概率法、卡方检验对计数资料进行分析，相关性检验通过Pearson相关分析，数据分析以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 AEDs致敏性组织中HLA-B*1502表达 AEDs致敏性组HLA-B*1502表达阳性率显著高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。分析AEDs致敏性患者病例中HLA-B*1502表达，发现HLA-B*1502表达在患者年龄、性别等方面无显著性差异(P>0.05)(见表1)。

2.2 AEDs致敏性组织中HLA-B*1502的表达与致敏药物的数量相关性分析 多药致敏组HLA-B*1502基因阳性表达高于单药致敏组；抗癫痫药物高敏综合征组HLA-B*1502基因阳性表达高于轻型药疹组，HLA-B*1502表达水平越高，致敏药物越多(见表2、图1)。

表1 患者的血液标本中HLA-B*1502表达情况

与健康对照组比较#P<0.05

表2 AEDs致敏性HLA-B*1502的表达与致敏药物的数量、皮肤不良反应的临床表现的严重程度情况

多药致敏组与单药致敏组比较#P<0.05；抗癫痫药高敏综合征组与轻型药疹组比较*P<0.05

图1 HLA-B*1502表达水平与致敏药物数量相关性分析

3 讨 论

癫痫是小儿与成人神经系统常见疾病之一。据统计全球平均每年每10万人就有50例新发病例，总共约有5000万癫痫患者，其中又以儿童及青少年居多，常常影响患儿的神经生理发育及生活质量[5]。目前口服抗癫痫药物仍是临床上治疗的主要方法，包括新旧抗癫痫药物，简称AED，临床上广泛应用于癫痫、神经痛、精神性疾病等方面，大部分为AEDs，该类药物最常见的不良反应是引起皮疹，轻者为斑疹、丘疹或斑丘疹(MPE)，严重时甚至出现超敏综合征(HSS)、史蒂文斯-约翰综合征(SJS)或中毒性表皮松解坏死(TEN)等，表现为皮肤水泡样皮疹，皮肤脱落，累及皮肤黏膜、内脏躯干及四肢，整体皮肤表面积分离，致死率高达40%[6～8]。临床常用的芳香族抗癫痫药物主要包括卡马西平、奥卡西平、拉莫三嗪、苯妥英钠、苯巴比妥等，可有新近研究也提示非芳香族抗癫痫药也可诱导机体高敏反应。虽然由AEDs诱发的严重过敏反应发病率较低，但是因其严重威胁患者的生命和用药安全，越来越受到相关领域专家学者的重视[9]。

目前认为药疹的发生是一种免疫应答反应，目前多观点认为，AEDs在身体经酶代谢后与蛋白多肽形成半抗原复合物，诱发后来的过敏反应。引发的过敏反应在不同人种、不同民族、地缘远近地区中也有所不同[10]。这说明过敏反应可能与基因相关，而近年来的研究报道指向AEDs致敏反应与HLA等位基因具相关性，而且该基因在中国人群中比例较高。HLA是人类基因调控人体免疫应答特异性及影响个体疾病易感性差异的主要多态性系统，有研究表明，HLA-B*1502基因与CBZ引起的SJS、TEN密切相关，且mRNA表达水平显著高于耐受组[11]。有研究显示中国台湾和香港地区癫痫患者应用CBZ引致的SJS、TEN和HLA-B*1502有较强的相关性[12]。在中国汉族人群中，8%～15%或更多的人可能是HLA-B*1502阳性基因型。目前该基因与所有的AEDs的相关性尚不确定，需要临床研究提供进一步的证据[13]。目前大陆地区相关方面的临床研究少见报道，且已有报道样本尚少，佛山地区尚缺乏相关地区的基因筛查及流行病学调查[14]，本课题就是进一步研究我地区AEDs引起的过敏反应是否和HLA-B*1502基因相关，如能明确HLA-B*1502阳性基因型是AEDs致敏的必要条件，对指导临床用药有很大意义，可以在长期服药前进行基因筛查，避免致敏的可能，减少病患的痛苦及减轻不必要的医疗支出。

在本研究中，我们通过对75例AEDs致敏性组织HLA-B*1502的阳性表达情况，分析致敏药物的数量、皮肤不良反应不同与HLA-B*1502基因表达的差异性，结果显示，在AEDs致敏组中阳性表达要远高于阴性表达，差异具有统计学意义，与王蕊艳等[15]研究结论相似。结果表明HLA-B*1502表达阳性率增高与AEDs致敏性的发生可能有密切的关系。目前国内外研究显示，常见的芳香族类AEDs包括多个种类，芳香族类AEDs的化学结构中均含有芳香环，氧化代谢产生含有芳香环的中间产物，在细胞色素P450酶的作用下，该中间产物在环氧化物羟化酶的作用下生成能溶于水的代谢产物，当肝脏环氧化物羟化酶缺乏或功能缺陷时，经肾脏排出体外，芳香类氧化物大量堆积，进而诱导细胞凋亡，结合形成大分子物质，同时激活特异性T淋巴细胞，诱导皮肤不良反应的发生，启动机体免疫反应，因此芳香族类AEDs诱发皮肤不良反应的发生率较高[16]。全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS) 被越来越多地应用于遗传异质性的研究中，越来越多的研究发现，遗传异质性与人类白细胞抗原(human leukocytes antigen,HLA)基因密切相关[17]。已有研究证实了，AEDs致敏导致的皮肤不良反应与HLA-B*1502基因型有关[18]。既往研究仅分析AEDs所致皮肤不良反应与HLA-B*1502等位基因的相关性。但并未对比轻型药疹与重症药疹、多药致敏与单药致敏之间HLA-B*1502等位基因表达的差异。本研究分析了HLA-B*1502的表达与AEDs致敏性的关系，发现且多药致敏组HLA-B*1502基因阳性表达高于单药致敏组，抗癫痫药物高敏综合征组HLA-B*1502基因阳性表达高于轻型药疹组，通过相关性分析发现，HLA-B*1502表达越高致敏药物数量越多。

本研究未收集HLA-B*1502的表达与AEDs致敏性预后的影响，因此我们将在之后的研究中进一步扩大样本量，详细收集AEDs致敏性药物干预对AEDs致敏性预后的影响，分析HLA-B*1502的表达在药物治疗效果的差异性和耐药性中的作用。综上所述，HLA-B*1502在AEDs致敏性的发生发展中扮演重要的角色，HLA-B*1502可能成为AEDs致敏性的治疗的新靶点，对AEDs致敏性诊断及预后有重要的价值。

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