某猪场猪流行性腹泻病的病原检测

胡宏伟 ，余丽花 ，樊延明 ，李志赛 ，肖啸 ，代飞燕

（1.云南省易门县动物卫生监督所，云南 易门 651100；2.云南省香格里拉市动物卫生监督所，云南 香格里拉 674400；3.云南省华坪县通达乡农业综合服务中心，云南 华坪 674800；4.云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201；5.云南农业大学动物医院，云南 昆明 650031）

猪流行性腹泻是一种由猪流行性病毒引起的急性、高度接触性肠道传染病[1]，以呕吐、腹泻和食欲下降为基本特征，猪流行性腹泻病毒（PEDV）是冠状病毒科冠状病毒属的一员。发病猪是本病的主要传染源，病毒主要分布在肠系膜淋巴结和小肠绒毛上皮细胞，随粪便排出后通过污染环境中的饲料、饮用水及生产设备等进行传播[2]。一周龄仔猪腹泻达3～4d，表现为严重脱水，死亡率达50%，最高为100%[3]。近年从中国分离到的CV777毒株是该病毒的一个新基因型[4]。

1 材料与方法

1.1 试验动物 从山东夏津县某猪场随机选择10头未经治疗的流行性腹泻病死仔猪。

1.2 试验方法

1.2.1 免疫胶体金层析试纸检测 取免疫胶体金检测试纸，在吸附孔中加入病死仔猪的肠内容物样品，吸附3min，即可获得免疫胶体金层析试纸的检测结果。

1.2.2 荧光定量PCR检测

1.2.2.1 检测样品 猪场里腹泻症状明显的哺乳仔猪小肠内容物，环境取样棉拭子及料线中的母猪饲料样品。小肠内容物取样：用消毒棉线结扎一段小肠的两端，用火焰灼烧后的刀片在结扎端外侧割断肠管。从采集的10份病猪肠道内容物中随机抽取4份进行检测，从5份料线样品和5份环境样品中分别抽取2份进行检测。

待检病料处理：用0.01mol/L磷酸缓冲液将病料稀释成10%的悬液，然后1000r/min离心10min。取上清，加入氨苄青霉素和链霉素，在37℃温箱中作用 1～2 h，-70℃下保存备用。

1.2.2.2 病毒增殖 将处理好的病料接种于长满单层的IBRS-2细胞，盲传几代至出现明显细胞病变，收集病毒液-70℃冻存待用。IBRS-2细胞的培养方式根据常规传代培养方法进行。

（1）引物设计：参考刘邓等[4]发表的“Taq Man荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒”的方法设计上游引物 P1 为 5′-AACAAATCCAGGGCCACTT-3′，下游引物 P2 为 5′-TAAACTGGCGATCTGAGCA-3′。

（2）病毒核酸的提取：取300μL彻底融化的病毒液，加入500μL裂解液RL，室温静置2min，将gDNA Eraser Spin Column安放到2mL Collection Tube上，将裂解液转移到gDNA Eraser Spin Column中；12000r/min 离心 1min，弃 DNA Eraser Spin Column，保留2mL Tube中的滤液；然后加入等体积的70%乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀，立即全部转入RNA Spin Column中；12000r/min离心1min，弃滤液；加入500 μL Buffer RWA 至RNA Spin Column中，12000r/min离心30s，弃滤液；加入600μL Buffer RWB至RNA Spin Column中，12000r/min离心30s，弃滤液，然后重复此步骤；将RNA Spin Column重新安置于Collection Tube上，12 000 r/min离心2 min；再次将RNA Spin Column安置于1.5 mL RNase-Free Collection Tube上，在RNA Spin Column膜中央处加入50μL RNase-Free ddH2O，室温静置5min；12 000r/min离心2min，洗脱RNA；采用紫外吸收法测定RNA纯度。

（3）反转录合成病毒cDNA：使用通用引物作为反转录引物，根据表1反转录系统和条件合成病毒cDNA。

表1 反转录反应体系

（4）用反转录合成的cDNA进行荧光定量PCR扩增，反应体系如表2所示。反应条件为：95℃ 10min，95℃ 15s、60℃ 1min，40 个循环。

2 结果

2.1 免疫胶体金层析试纸检测 免疫胶体金层析试纸检测结果（图1）显示：对照线（C线）为阳性，对照成立；检测线（T线）为阳性，样品判断为阳性。

图1 免疫胶体金层析试纸检测结果

2.2 荧光定量PCR检测 结果（表3）显示：检测样品 1、2、3、4 均为 PEDV阳性。

表3 肠内容物荧光定量PCR检测结果

为进一步确定引起此次猪流行性腹泻的来源，我们同时对猪场内的环境采样和料线采样进行了检测，结果显示：料线样品1、2和环境样品1、2均为PEDV阳性，如表4所示。

表4 环境和料线样品的荧光定量PCR检测结果

3 讨论

与常规PCR相比，本试验使用的荧光定量PCR不仅可以定量检测，而且更具体、更灵敏。料线检测结果呈阳性，提示本次猪流行性腹泻病毒很可能来源于料线中，环境样品检测结果呈阳性，是因为场内猪只感染病毒后持续向外排毒引起环境污染，故要定期对猪场环境进行消毒。

4 结论

通过免疫胶体金层析试纸进行初筛，再用荧光定量PCR进行验证，最终确定引起该猪场仔猪流行性腹泻的病原为PEDV，且病原主要来自料线中，所以要注意料线的安全性。

[1] 甘振磊，李春燕，王彬，等.猪流行性腹泻特点及流行现状的研究[J].猪业科学，2010（12）：24-28.

[2] 罗满林.动物传染病学[M].北京:中国林业出版社，2013：195-200.

[3] 施标，董世娟，朱于敏，等.中国猪流行性腹泻病毒分子流行病学研究进展[J].中国农业科学，2013，46（20）：4362-4369.

[4] 刘邓，袁秀芳，冉多良，等.TaqMan荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒方法的建立与初步应用[J].中国动物传染病学报，2010，18（1）：28-33.