不同溶媒提取对灵芝中灵芝酸A的药动学影响

刘晓峰，张 娜，王丹丹，姜沅彤，赵 岩

灵芝在日常生活中被人们广泛使用，其所含三萜类活性成分主要具有镇痛、镇静、保护心肌缺血、抗病毒、抑菌、保肝护肝、强心降压、解痉平喘、止咳祛痰及抗肿瘤等药理作用[1]。为探讨不同溶媒提取是否对其活性成分灵芝酸A的药动学特性有影响[2-3]，本研究分别以水和乙醇为溶媒提取灵芝活性成分后给大鼠灌胃，采用高效液相色谱法测定大鼠血浆中灵芝酸A的含量，计算相应的药动学参数，为合理、有效选用溶媒提供参考，为临床合理使用该类药品提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：雄性Wistar大鼠，体重260～280 g，购于吉林大学实验动物中心，动物合格许可证号：SCXK(吉)2008-0005。大鼠给药前禁食12 h，实验期间自由饮水。

1.2 药品与试剂：灵芝酸A标准品(上海原液生物科技有限公司，批号：20140305)，灵芝乙醇提取物，丙酸睾酮标准品(萨恩化学技术有限公司，批号：20140517)，乙腈色谱纯，甲醇色谱纯，冰乙酸，95%乙醇，娃哈哈纯净水(杭州哇哈哈公司提供)。

1.3 仪器：LC3000型高效液相色谱仪(北京创新通恒科技有限公司)，KQ-250B型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，FW-100型高速万能粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司)，TG628A分析电子天平(上海皖衡电子仪器有限公司)，电热恒温水浴锅(北京国华医疗器械厂)，AvantiTM J-301冷冻高速离心机(美国BECKMAN)，RE-52AA旋转蒸发仪(上海美普达仪器有限公司)，冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)。

2 结果

2.1 色谱条件色谱柱：采用大连江申分离科学技术公司C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温30 ℃，检测波长254 nm，流速1 mL/min，流动相为乙腈-0.1%冰乙酸水，进样量20 μl。

2.2 专属性考察：取大鼠空白血浆，含灵芝酸A和内标丙酸睾酮的对照溶液及处理后的生物样品溶液，按照“2.1”条件进行操作，结果见图1(目录后)。结果显示，灵芝酸A和内标(丙酸睾酮)的保留时间分别为7.617、9.954 min，且血浆中内源性等物质不干扰灵芝酸A和内标的测定。

2.3 溶液的配制

2.3.1 标准品溶液和内标溶液的配制：分别取灵芝酸A和丙酸睾酮对照品适量，精密称定，以甲醇为溶剂，分别配制成浓度为10 μg/mL的溶液，备用。

2.3.2 供试药品制备

2.3.2.1 水煎液制备：取灵芝子实体饮片250 g，加适量水浸没药材30 min，加8倍量水加热煮沸10 min，转入小火煎30 min，趁热过滤，药渣用同法提取2次，合并3次煎液，浓缩至干，备用。用时以适量水混悬，现用现配。

2.3.2.2 醇提取液制备：取灵芝子实体饮片250 g，用60%乙醇浸没药材用索氏提取器提取，提取1 h后回收乙醇，浓缩至干，备用。用时以适量水混悬，现用现配。

2.4 动物试验：取Wistar大鼠，雌雄各半，随机分为6组，每组6只。分别灌胃水提取物和60%乙醇提取物高剂量组1 840 mg/kg、中剂量组920 mg/kg、低剂量组180 mg/kg。在给药2、5、10、20、40、60、120、240、360、480、720、1 440 min后，眼后静脉丛取血，收集于肝素化管中，37 ℃水浴保温30 min，冷冻离心10 min(3 500 r/min)，取上清液进行血药浓度分析。给药1 h后给大鼠供水。

2.5 血浆样品处理：将“2.4”项下血样离心，取0.1 mL血浆加入0.9 mL丙酸睾酮内标液(0.1 mg/mL)，5 000 r/min离心10 min，分离上清液，精密吸取上清液，置于2 mL离心管中，蒸干后用色谱甲醇定容至100 μl。用滤膜(0.45 μm)过滤，待测。

2.6 线性关系考察：取空白大鼠血浆100 μl，制成相当于灵芝酸A血浆浓度,分别为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL的生物样品，按“2.4”项下进行处理；进样20μl，以灵芝酸A系列对照品浓度(μg/mL)为横坐标轴(X)，以灵芝酸A与内标的峰面积比(A

药/A内标)为纵坐标轴(Y)，得校正曲线Y=2.1151x+0.2174，r=0.999 7(n=5)，结果表明血浆样品中灵芝酸A在0.2～10 μg/mL范围内线性关系良好。

2.7 精密度与回收率试验：取空白大鼠血浆100 μl，分别加入一定量的灵芝酸A，配置成灵芝酸A浓度分别为0.2、2、10 μg/mL的低、中、高三个生物样品。按“2.4”进行处理，连续测定3 d的精密度，并以处理后的峰面积与未经处理直接进样测得的色谱峰面积之比，考察生物样品的回收率，见表1。

表1 灵芝酸A回收率与精密度试验

2.8 血浆药物浓度-时间曲线：按“2.4”项下以时间为横坐标，血药浓度为纵坐标，绘制药-时曲线，见图2-图3(目录后)。

2.9 药动学参数分析：将“2.8”项下的血药浓度-时间用“3P97”药动学软件拟合分析计算结果，其药动学参数见表2。结果显示，大鼠灌胃灵芝酸A 水溶液、60%乙醇溶液提取物后其药动学行为符合二室模型。低剂量组除Lag time参数外，其他参数的差异均有统计学意义；在中剂量组，除Lag time参数外，其他参数的差异均有统计学意义；在高剂量组，除V/F参数外，其他参数的差异均有统计学意义；可认为60%乙醇溶液提的灵芝酸A参数，T1/2alpha、T1/2beta、AUC和T1/2Ka在各剂量组均高于水溶液提取，其他参数则有高有低。

表2 不同溶媒提取灵芝酸A的药动学参数

注：*和水溶液提取组相比较，P<0.05。

3 讨论

灵芝在日常生活中人们用其浸泡药酒进行保健，在中医方剂中依据治疗疾病的不同用于中药药物治疗[4]，以及依据灵芝有效成分开发有灵芝片、灵芝糖浆等[5-6]。从文献可以看出在灵芝的使用过程中，不同溶媒的提取对灵芝中活性成分的有效、合理利用没有任何依据。浸泡药酒会不会因为酒中乙醇极性大，提取物的浓度高导致生活中长期使用蓄积中毒，中医方剂中用于水煎煮有没有完全提取灵芝有效成分达到治疗作用。通过本研究的比较为水提取和乙醇提取，给灵芝使用提供了相应参考。

研究通过比较灵芝水溶液、60%乙醇提取物给大鼠灌胃后大鼠体内灵芝酸A的药动学参数发现，大鼠灌胃60%灵芝乙醇提取物高、中、低浓度后灵芝酸A在大鼠体内的AUC分别为(601.109±6.012)μg/(mL·h)、(541.847±5.892)μg/(mL·h)、(506.739±5.789)μg/(mL·h)，经过与水提取物给大鼠灌胃后AUC比较差异有统计学意义，结果说明60%乙醇提取物给大鼠灌胃后灵芝酸A的生物利用度相对较高，而水溶液提取物的相对生物利用度较低。由于溶媒极性的不同导致2种提取物中化学组分不同，从而各成分间的体内相互作用影响灵芝酸A在大鼠体内过程，使起生物利用度存在显著差异，是否产生不同的药效学需要进一步考察。

[1] 彭杨芷,苏悦,芦光亮,等.灵芝主要功效现代研究进展[J].亚太传统医药,2016,12(18):71.

[2] 杨冬梅,张毅,刘俊,等.不同溶媒在不同提取方法下对吴茱萸总碱提取率的影响[J].安徽医药,2016,16(6):765-766.

[3] 邵艳华,高俊丽,李 倩,等.穿心莲内酯类成分在不同溶媒中的化学稳定性研究[J].华西药学杂志,2016,31(1)：68-71.

[4] 周莉云.浅析灵芝的药理和功效[J].中国民族民间医药,2013,10(9):11-12.

[5] 肖智杰,王进军,连宾.灵芝产品的研究与开发现状[J].食品科学,2006,27(12)：837-842.

[6] 陈祖琴,黄文丽,金鑫.我国灵芝精深加工研究进展[J].食品安全质量检测学报,2016,7(2):639-644.