可降解络合剂对黑麦草种子萌发和幼苗生长的影响

王思予，赵树兰，多立安

（天津师范大学生命科学学院，天津300387）

随着工业技术的发展，环境问题日益突出，重金属污染土壤的问题屡见不鲜。目前，世界各国土壤均存在不同程度的污染，全世界平均每年排放Hg、Cu、Pb、Mn、Ni的量，分别约为1.5×104、3.4×106、5×106、1.5×107和1.5×106t。我国受Cd、Hg、As、Cr、Pb污染的耕地面积约2×107hm2，每年因重金属污染而损失的粮食约100万t［1］，因此人们越来越重视重金属污染土壤的修复。植物修复技术属于原位修复技术，其成本低、环保无污染，植被形成后具有保护表土、减少侵蚀和水土流失的功效，可大面积应用于矿山的复垦、重金属污染场地的植被与景观修复［2］。

为增加重金属在土壤中的溶解性，络合剂常被用来活化土壤中的重金属，促进植物对重金属的吸收及向地上部转移，达到提高植物提取效率的目的［34］。EDTA（乙二胺四乙酸）是一种常用络合剂，去除重金属的效果好，且浓度越高、时间越长、次数越多，去除效果越好［5］。但EDTA难降解，在环境中存留时间长，会再次污染深层土壤，甚至污染地下水［6］。目前，土壤重金属修复研究都在寻找可生物降解的螯合剂［7］。

GLDA，谷氨酸二乙酸四钠，主要由植物原料制备而成，容易生物降解，与金属离子的螯合能力不低于EDTA、EDDS的螯合能力。有研究表明，GLDA可以去除污泥中的重金属［8］，并且可以有效促进东南景天提取污染土壤中的重金属［9］。IDS，亚氨基二琥珀酸四钠盐，是一种新型的氨基羧酸类螯合剂，具有很强的螯合过渡金属离子和碱金属离子的能力，尤其对铁、铜离子的螯合能力极佳。此外，IDS具有生物可降解性。有研究表明，IDS可以作为一种潜在的有效螯合剂来去除电池工业污泥中的重金属［10］。

草坪草大部分是禾本科草本植物，主要特点是耐性强，抗病性好，耐粗放管理，易于成活，一年可刈割多次，产生很大的生物量，同时还是城市绿化建设的主要组成部分，因此可选择草坪植物作为重金属污染土壤的修复材料。利用GLDA和IDS去除重金属的研究有少量报道，但2种络合剂对草坪植物萌发和生长的影响未见报道。本研究将不同浓度的GLDA和IDS加入草坪基质中，研究可生物降解络合剂对黑麦草种子萌发和幼苗生长的影响，为可降解络合剂应用于重金属污染土壤修复提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

实验植物选取我国北方常见的多年生黑麦草（Lolium perenneL.）。土壤取自校园内0～20 cm的表层土壤，自然风干、碾碎，过筛，备用。土壤质地为砂质粘土，p H＝7.44，有机质含量4.68%，全氮0.21%，全钾45.61%，有效磷22.03 mg／kg，饱和含水量56%，容重0.87 g／cm3。GLDA 购于阿克苏诺贝尔（Akzo Nobel）化工有限公司，p H＝10～11，有效含量为47.4%，IDS购于中国河北省石家庄开发区德赛化工有限公司，密度1.32～1.35 g／cm3，p H＝10.3～11.4，有效含量为75%。

1.2 黑麦草的培养

选取直径为6.8 cm、高为7.8 cm的塑料盆，装入150 g土壤。选择籽粒饱满的黑麦草种子，预先在黑暗条件下清水浸泡24 h，每盆播种100粒。播种后添加2种络合剂，设置5个处理浓度：3，6，9，12 mmol／kg和15 mmol／kg，分别以GLDA 3、GLDA 6、GLDA 9、GLDA 12、GLDA 15和IDS3、IDS6、IDS9、IDS12、IDS15表示，以不添加络合剂的处理（0 mmol／kg）为对照；每个处理3次重复。黑麦草培养期间室内温度为18～25℃，相对湿度为35%～65%，光照为透入室内的自然光（6 856～2 7090 lx）。每天补充水分，保证土壤含水量为最大持水量的70%，供植物正常生长所需。

1.3 方 法

1.3.1 种子萌发相关指标测定

种子胚根长出并超过种子长度的1／2视为萌发，当萌发第7天时，萌发达到稳定，测定发芽率，计算发芽指数、萌发速率系数和萌发值［1113］。

发芽率（%）＝发芽种子数／供试种子数×100%；

发芽势（%）＝萌发4 d内发芽种子数／供试种子数×100%；

发芽指数（GI）＝∑（Gt／Dt）（式中，GI为发芽指数，Gt为在t日的发芽种子数，Dt为相应的发芽天数）；

萌发速率系数（%）＝［∑（t×n）／∑n］×100%（式中，t为自萌发试验开始时的天数，n为在t天内萌发的种子数）；

萌发值（GV）＝MDG×PV（式中，MDG为平均每天萌发的幼苗数，PV为日累积萌发幼苗数除以试验时间所得最大值）。

1.3.2 植物生长指标测定

发芽后每5天测定1次株高，随机选取每盆中5株长势匀称的植株，取其平均株高。黑麦草播种30 d后刈割，地上部分108℃下杀青20 min，80℃烘干至恒重。地下部分，用清水洗净，用滤纸吸去根外部的水分，80℃烘干至恒重。

1.3.3 叶绿素和类胡萝卜素的测定

取0.2 g鲜叶片，剪成1～2 mm碎片，浸泡于20 m L丙酮乙醇（V∶V＝1∶1）溶液中，避光浸泡24 h至叶片完全脱色，浸泡液为待测液。用紫外可见分光光度计于波长663、645 nm和470 nm下测量吸光值，并根据公式计算叶绿素和类胡萝卜素的含量。

叶绿素a的浓度Ca（mg／L）＝12.72A663－2.59A645；

叶绿素b的浓度Cb（mg／L ）＝ 22.88A645－4.67A663；

总的叶绿素浓度C T（mg／L）＝C a＋Cb＝20.29A645＋8.05A663；

叶绿素含量（mg／g）＝总叶绿素浓度×提取体积／植物鲜重；

类胡萝卜素的总浓度C xc（mg／L）＝（1 000A470－2.05Ca－114.8Cb）／245；

类胡萝卜素含量（mg／g）＝类胡萝卜素浓度×提取体积／植物鲜重。

1.4 数据处理

数据采用SPSS 19.0进行单因素方差分析（Oneway ANOVA），并采用Tukey法，在p＝0.05水平进行数据差异显著性检验；采用Microsoft Excel 2007绘制图表，文中数据为平均值±标准误（n＝3）。

不同浓度的GLDA和IDS对黑麦草种子萌发和幼苗生长的综合影响采用隶属函数法进行评价，计算公式：R（X j）＝（X j－Xmin）／（Xmax－Xmin）［14］。

式中X j为第j个综合指标，Xmin、Xmax分别为第j个综合指标的最小值和最大值。然后用各指标的隶属函数值相加来计算综合评定值。

2 结果与分析

2.1 不同络合剂对黑麦草种子萌发的影响

播种后第3天，黑麦草种子开始萌发，第10天达到萌发稳定。施加络合剂GLDA和IDS对黑麦草的发芽势、发芽率、发芽指数、萌发速率系数以及萌发值的影响均随着浓度的增加呈明显的抑制趋势，且高浓度络合剂的影响达到显著水平（p＜0.05，表1）。

发芽率随着络合剂浓度的增加而降低，对照组的发芽率最高为79.33%；15 mmol／kg GLDA处理与对照差异显著（p＜0.05），仅为对照的12.61%。发芽势表现出和发芽率相同的趋势，随着络合剂浓度的增加，也受到明显抑制，添加GLDA的处理均与对照差异显著（p＜0.05），其中GLDA浓度为15 mmol／kg的处理与对照差异最显著，仅为对照的1.48%。发芽指数和萌发速率系数最高的均为对照组，只有3 mmol／kg IDS处理，和对照差异不显著（p＞0.05）。萌发值也表现出和其它发芽指标相同的趋势，随着络合剂浓度的增加，受到明显的抑制。

2.2 不同络合剂对黑麦草株高的影响

黑麦草幼苗株高动态如图1所示。生长初期，播种10 d时，添加GLDA的处理组均与对照组差异显著（p＜0.05），当络合剂浓度为15 mmol／kg时，植株几乎未生长。在生长中期，从15～25 d，对照株高平均生长率为0.12 cm／d。添加IDS浓度为3，6，9 mmol／kg处理，植株生长迅速，平均生长率高于对照组。添加GLDA浓度为15 mmol／kg处理生长最缓慢，到25 d株高仅为3.23 cm，与对照差异显著（p＜0.05）。生长30 d后，对照株高为10.53 cm；3 mmol／kg IDS处理生长最快，株高为11.47 cm，而添加GLDA和IDS浓度为15 mmol／kg的处理组几乎未生长，且与对照差异显著（p＜0.05），分别为 对 照 的 34.47% 和68.09%。

表1 不同浓度络合剂对黑麦草种子萌发指标的影响

图1 络合剂GLDA（A）和IDS（B）对黑麦草株高动态的影响

图2 添加络合剂GLDA和IDS对黑麦草地上和地下干重的影响

2.3 不同络合剂对黑麦草生物量的影响

添加不同浓度的络合剂对黑麦草地上和地下干重的影响见图2。当络合剂浓度为6 mmol／kg时，地上干重均为最大；当络合剂浓度为15 mmol／kg时，地上干重均为最小，且均与对照差异显著（p＜0.05）。络合剂显著抑制了黑麦草地下根系的生长，地下干重均以对照组为最高；GLDA浓度为3 mmol／kg的处理地下干重与对照差异不显著（p＞ 0.05）。GLDA 和IDS 浓 度 为 15 mmol／kg的处理地下干重最小，与对照差异显著（p＜0.05），仅为对照的3.70%。

2.4 不同络合剂对黑麦草叶绿素和类胡萝卜素含量的影响

不同络合剂对黑麦草叶绿素及类胡萝卜素含量的影响如表2所示。2种络合剂浓度为3，6，9 mmol／kg处理叶绿素a与对照相比，含量较高，且与对照差异显著（p＜0.05）；GLDA 和IDS浓度为9 mmol／kg的处理叶绿素b和总叶绿素含量最高，与对照差异显著（p＜0.05）；当 GLDA 和IDS浓度为6 mmol／kg时，类胡萝卜素含量最高，较对照分别增加了58.11%和48.65%（p＜0.05）。

表2 不同浓度络合剂GLDA和IDS对黑麦草叶绿素和类胡萝卜素含量的影响

表3 添加络合剂对黑麦草各指标影响的隶属函数分析

2.5 不同络合剂对黑麦草萌发和幼苗生长的综合评定

采用隶属函数法分别就添加不同浓度络合剂对黑麦草种子萌发和幼苗生长的综合影响进行评定（表3）。结果表明，添加络合剂IDS浓度为6 mmol／kg的处理组生长状况最佳，影响最大的是15 mmol／kg处理组，且与对照差异显著（p＜0.05），添加高浓度络合剂不利于黑麦草生长。2种络合剂对黑麦草种子萌发和幼苗生长的综合评定排名顺序为：IDS 6、IDS 3、GLDA 6、GLDA 3、CK、IDS 9、GLDA 9、IDS 12、IDS 15、GLDA 12、GLDA 15处理。

3 讨论与结论

近年来，络合剂在植物修复重金属污染土壤中的应用研究越来越多。EDTA虽然增加植物对重金属的吸收和富集，但往往会抑制植物生长，减少生物量。廉菲等研究表明，络合剂EDTA会强烈抑制黑麦草的发芽率、株高和生物量等［15］。Sinegani等的研究发现，EDTA对植物生长具有强烈的抑制作用，表现在显著减少出苗和干重［16］。

本研究发现，可降解络合剂GLDA和IDS对黑麦草种子萌发表现出一定的抑制作用，这与贾丽娜等［11］的研究结果相同，且进一步影响其幼苗生长，低浓度络合剂处理的15 d内并未显示明显的优势，但15 d后，生长状况超过对照。添加低浓度的2种络合剂时，黑麦草地上生物量较对照相比显著增加，株高在20 d后，生长迅速。当络合剂浓度增大，超过适宜浓度，则对植物根系生长产生抑制作用，这与罗艳等［17］的研究结果相一致。叶绿素是与光合作用相关的最重要的一类色素，而类胡萝卜素也是与光合作用相关的一类色素，还是活细胞中生物合成的产物，对细胞起到保护作用［18］。本研究发现，2种络合剂对叶绿素和类胡萝卜素的影响为低浓度促进、高浓度抑制，这和张灿灿等［19］研究EDTA对高羊茅叶绿素含量的影响结果相一致。通过多指标的测定，采用隶属函数分析对黑麦草的萌发和生长进行了综合评价，避免了单一指标的片面性，较为全面地反映2种络合剂GLDA和IDS对草坪植物种子萌发和幼苗生长的影响，使结果更具科学性。综合评定值越大，表明添加该浓度络合剂对种子萌发和幼苗生长的促进作用越明显［14］。各项萌发指数是表现植物萌发状态的重要指标，株高和生物量是衡量植物生长的重要指标，叶绿素和类胡萝卜素与植物的光合作用相关，因此在综合分析浓度的情况下，要参考以上各项指标。

综上所述，低浓度络合剂对黑麦草种子萌发和生物量有抑制作用，但可以提高株高和叶绿素、类胡萝卜素含量。而高浓度络合剂对黑麦草萌发和幼苗生长产生显著的抑制作用，表现出明显的伤害。通过隶属函数分析对各个指标进行综合评定，添加2种络合剂浓度不大于6 mmol／kg时均好于对照，以IDS浓度为6 mmol／kg的处理生长状况最佳。

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