水分胁迫和盐分胁迫对粗糙龙胆种子萌发的影响

陶 玲，尹海波，李 旭，邵 飞，贾晓晴

（辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连116600）

龙胆为我国常用中药，2015版药典规定其来源为龙胆科（Gentianaeeae）植物条叶龙胆（Gentiana manshuricaKitag.）、龙胆（Gentiana scabraBge.）、三花龙胆（Gentiana triflorapall.）或坚龙胆（Gentiana rigescensFranch.）的干燥根及根茎。前3种习称“关龙胆”，后一种习称“坚龙胆”，具有清热燥湿、泻肝胆火的功效［1］。关龙胆被称为辽药六宝之一，市场需求量大，近年来野生资源处于濒危状态，人工栽培龙胆成为市场的主要药材来源。辽宁省抚顺市清原县拥有辽宁最大的龙胆栽培基地，栽培品种为龙胆（Gentiana scabraBge.），即粗糙龙胆。全县龙胆草种植面积达2 466 hm2，年产量1 600 t，占全国市场份额的82%。但龙胆草种子细小，千粒重仅为24～32 mg［2］，加之近年来水资源供应的短缺以及土壤盐渍化等问题的凸显，直播发芽率较低。本实验人工模拟水分及盐分2种环境胁迫，研究不同干旱程度、不同盐分浓度下龙胆种子的发芽特性，为粗糙龙胆人工栽培和规范化种植提供指导。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验用龙胆种子为2016年9月采于抚顺市清原县英额门镇英额门村的3年生成熟种子。

1.2 方 法

1.2.1 水分胁迫对龙胆种子萌发的影响

将PEG6000用去离子水溶解，分别配制成5%、10%、15%、20%的溶液，p H＝7.0的去离子水处理组作为对照组。取成熟饱满的种子适量，1%次氯酸钠浸泡消毒15 min后，用去离子水冲洗掉表面残留的次氯酸钠溶液。将2层滤纸放置于直径9 cm的培养皿中，培养皿经酒精消毒。每个培养皿放置100粒成熟饱满的种子。用一次性针管吸取5 m L处理液于各处理组中，共5个处理组，每处理3次重复，放入25℃人工气候箱中培养，光周期为11 h光照／13 h黑暗。用称重法补充每天损失的水分。

1.2.2 盐分胁迫对龙胆种子萌发的影响

将分析纯的 NaCl分别配制成45，90，135，180，225 mmol／L的溶液，p H＝7.0的去离子水处理组作为对照组。种子前期处理方法与1.2.1一致。用一次性针管吸取5 m L处理液于培养皿中，每皿100粒种子。共6个处理组，每处理3次重复，放入25℃人工气候箱中培养，光周期为11 h光照／13 h黑暗。用称重法补充每天损失的水分。

1.2.3 种子萌发指标的测定

置床72 h后每天同一时间观察种子萌发情况（本实验规定置床之日为1），当种子露白（胚根突破种皮1 mm时）时视为萌发［3］。种子停止萌发时每个培养皿随机抽取3株幼苗测量其长度。

发芽率（%）＝正常发芽的种子数／供试种子总数×100%；

相对发芽率（%）＝发芽种子数占对照萌发种子数的百分比；

发芽势＝发芽种子数达到高峰时正常发芽种子总数与供检种子总数的百分比；

“双十一”购物狂欢节，是指每年11月11日的网络促销日，源于淘宝商城（天猫）2009年11月11日举办的网络促销活动。下面我将列举从2009年至2017年“双十一”天猫和淘宝的总销售额以及各年销售额的增长率，如表所示：

发芽指数（GI）＝∑（Gt／Dt）（式中，Gt为不同时间（t，d）的发芽数，Dt为相应的发芽试验天数）

活力指数（VI）＝GI×S（式中，S为一定时期内幼苗长度cm，GI为发芽指数）；

平均发芽速度＝∑（D×n）／∑n（式中，D为从种子置床起算的天数，n为相应各天的发芽粒数）；

种子耐盐适宜范围＝发芽率达到对照发芽率75%时相对应的盐液浓度；

种子耐盐半致死浓度＝发芽率达到对照发芽率的50%的盐液浓度；

种子耐盐极限浓度＝发芽率达到对照发芽率的10%的盐液浓度。

1.3 统计方法

试验数据采用Excel 2016与SPSS 16.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫对龙胆种子发芽率的影响

由图1可知，随着NaCl浓度的递增，种子的发芽率呈现出明显降低的趋势。对照组的发芽率最高，为68%，而浓度225 mmol／L处理组的龙胆种子未见萌发。NaCl浓度与种子发芽率呈显著负相关（p＜0.05），回归方程为y＝－13.210x＋68.067，R2＝0.851 0。方差分析表明，45 mmol／L浓度组与对照组发芽率比较有显著性差异（p＜0.05），其他浓度组与对照组比较有极显著性差异（p＜0.01）。说明即使低浓度的盐分胁迫，也会抑制龙胆种子的萌发，这与郑伟等［4］，徐芬芬等［5］得出的低浓度盐胁迫促进种子萌发的结论并不相符，龙胆种子极其不耐盐。

图1 NaCl胁迫对龙胆种子发芽率的影响

2.1.1 NaCl胁迫对龙胆种子相对发芽率的影响

为进一步研究龙胆种子的耐盐程度，将相对发芽率与相对应的盐浓度之间进行相关回归分析（如图2）。结果表明，NaCl胁迫下的相对发芽率随盐溶液浓度的升高而降低，相对发芽率与NaCl溶液浓度表现出显著的负相关（p＜0.05），相关系数为0.851 0，回归方程为：y＝－19.427x＋100.10。以相对发芽率的75%、50%、25%时所对应的NaCl浓度作为龙胆种子发芽时盐胁迫的适宜值、临界值和极限值。得出NaCl胁迫时，龙胆种子在萌发期间盐胁迫的适宜值为13.15 mmol／L，临界值为71.06 mmol／L，极限值为128.97 mmol／L。

2.1.2 NaCl胁迫对龙胆种子发芽速度的影响

由图3可知，各浓度下龙胆种子发芽的动态变化，总体呈现出慢快慢的趋势，其中对照组趋势最为明显，第6天到第9天种子萌发速度快、数量多。45 mmol／L和90 mmol／L浓度组在发芽后期速度有小幅度的上升。135 mmol／L和180 mmol／L 2个浓度组趋势较为相似，比较平缓，225 mmol／L浓度下，种子未见萌发。由图3可以看出，不同浓度的NaCl不仅可以影响发芽率、发芽势、发芽速度等指标，还会对种子的初始发芽时间造成影响。对照组从第5天开始萌发，低浓度组（45～90 mmol／L）均从第7天开始萌发，135～180 mmol／L组从第10天开始萌发。种子初始发芽时间随着NaCl浓度增大不断延后。供试种子发芽所需的平均时间称为平均发芽速度，它是衡量种子发芽快慢的一个指标，在同一种类种子中，平均发芽速度的数值小，表示该批种子的发芽速度大，发芽能力越好［6］。在龙胆种子的整个萌发时间段内计算种子的平均发芽速度（见表1），可知随着NaCl浓度的递增，种子的平均发芽速度不断增大，种子的发芽能力随之降低。

表1 NaCl胁迫对龙胆种子萌发指标的影响

图2 NaCl胁迫对龙胆种子相对发芽率的影响

图3 NaCl对龙胆种子累计发芽率的影响

2.1.3 NaCl胁迫对龙胆种子发芽势、发芽指数、种子活力指数等指标的影响

计算龙胆种子的发芽势、发芽指数、幼苗长度、种子活力指数等指标，结果见表1。由表1可知，龙胆种子在不同浓度NaCl溶液胁迫下，整体发芽指数、发芽势、种子活力指数、幼苗长度均随着NaCl溶液浓度的增高呈现显著下降的趋势（p＜0.05）。种子活力其余浓度组与对照组比均有显著性差异（p＜0.05）。说明低浓度的NaCl溶液（＜45 mmol／L）可降低龙胆种子的活力，进一步表明龙胆种子在低浓度盐胁迫下不存在促进其发芽的情况。高浓度NaCl溶液明显减弱种子活力，强烈抑制其萌发。

2.2 水分胁迫对龙胆种子发芽率的影响

能够充分反映种子萌发情况的指标是发芽率，由图4可知，除了PEG浓度为5%的处理组比对照组发芽率稍有增高外，其余3组发芽率均随着PEG浓度的增高而呈下降趋势。对各组发芽率进行差异显著性检验发现，5%，10%浓度组与对照组相比无显著性差异，15%浓度组，20%浓度组与对照组比有极显著性差异（p＜0.01）。其中5%浓度组的发芽率比对照组还略有提高。说明适度的干旱刺激可以提高龙胆种子的发芽率。

2.2.1 水分胁迫对龙胆种子发芽速度的影响

由图5可知，龙胆种子在整个萌发期间内，整体呈现出慢快慢的生长趋势。对照组、5%浓度组、10%浓度组皆从第5天开始萌发，15%浓度组第8天开始萌发，20%浓度组始终未见萌发。种子萌发多集中在6～12 d。15 d后处于萌发的停滞期。第7天后，5%浓度组每天的累计发芽率皆大于对照组。计算龙胆种子的平均发芽速度（平均发芽速度值越小，发芽能力越强）见表2，随着PEG浓度的增加，种子的平均速度随之递增，但5%浓度组与对照组比无显著性差异，由此可见，低质量分数的PGE可以促进种子萌发，增大种子萌发速度，降低其平均萌发速度，高质量分数的PEG延缓种子发芽时间，减慢种子发芽速度，抑制种子萌发。

表2 水分胁迫对龙胆种子萌发的影响

图4 水分胁迫对龙胆种子发芽率的影响

图5 PEG对龙胆种子累计发芽率的影响

由表2可知，PEG质量分数在0～5%范围内，龙胆种子的发芽指数和发芽势呈升高的趋势，而后随着PEG浓度的加大，发芽势和发芽指数逐步降低。对照组和5%浓度组的种子日发芽数在第8天达到最高，故2组种子的发芽势定在第8天测定，分别为34.67%和36.67%。10%浓度组种子的发芽势定在第10天，为28%。15%浓度组发芽势延迟到第12天，为24.67%。由此可见，PEG质量分数的加大，会导致发芽势天数的延后，减弱种子的萌发能力。其中5%浓度组和10%浓度组种子的发芽指数与对照组相比无显著性差异，15%浓度组与对照组比较有显著性差异（p＜0.05），20%浓度组与对照组比较有极显著性差异（p＜0.01）。说明此时PEG浓度超过了龙胆种子萌发过程的渗透调节承受限度，对种子的萌发和生长均造成伤害。

2.2.2 水分胁迫对龙胆种子活力指数、幼苗长度及根茎比的影响

植物的正常生长需要合理的根茎比，如果根茎比过小，地上部分的水分和养分便难以输送到植物上部，植株也不会正常生长［6］。由表2可知，本次实验的根茎比、幼苗长度、种子活力指数均随着PEG浓度的增大而随之降低。根茎比5%浓度组与对照组数值相同，10%浓度组与对照组比差异不显著（p＞0.05），并有增大趋势。15%浓度组和20%浓度组与对照组比有极显著性差异（p＜0.01）。种子活力指数只有5%浓度组与对照组比无显著性差异，其余3组均与对照组有显著性差异（p＜0.05）。说明低浓度的PEG可以一定程度的促进种子萌发，对种子活力也不会过分抑制，进一步证明了龙胆种子具有一定的耐旱性。

3 结论与讨论

本实验分别采用培养皿中添加不同浓度NaCl处理液和利用PEG6000人工模拟干旱条件2种方法，比较盐分和水分2种环境胁迫对龙胆种子萌发的影响。试验相关分析表明，龙胆种子的发芽率与NaCl浓度之间呈现显著的负相关，种子发芽势、发芽指数、幼苗长度、活力指数均随着NaCl的增大呈显著下降的趋势，225 mmol／L浓度组始终未见萌发。通过回归分析得出，NaCl胁迫时，龙胆种子在萌发期间盐胁迫的适宜值为13.15 mmol／L，临界值为71.06 mmol／L，极限值为128.97 mmol／L。有研究发现，低浓度的盐胁迫可以促进种子萌发［7］，而本次试验中即使低浓度（45 mmol／L）的NaCl胁迫仍可以显著抑制龙胆种子的萌发，发芽率与对照组比有显著性差异（p＜0.05）。说明龙胆种子不耐盐，应尽量避免将龙胆种子播种在盐渍化的土壤中。

当PEG浓度为5%时，龙胆种子的发芽率、发芽势、发芽指数均较对照组有小幅度的上升，根茎比与对照组比有下降趋势但无显著性差异。说明适当浓度的PEG可以促进种子萌发，提高种子发芽率。10%浓度组的发芽率、根茎比、幼苗长度与对照组比无显著性差异，15%～20%浓度组发芽率，根茎比与对照组比有极显著性差异（p＜0.01）。种子活力指数除了5%浓度组与对照组比无显著性差异外，其余3组都有显著性差异（p＜0.05），当PEG浓度达到20%时，种子未见萌发。可见龙胆种子在萌发期间可承受的PEG浓度在10%以内，浓度达到15%时无论是对种子萌发还是幼苗生长均会造成显著抑制，龙胆种子不能萌发的PEG浓度的临界值为20%。龙胆种子的根茎比在PEG质量分数达到10%时有小幅度上升，有可能是龙胆种子对干旱胁迫环境的适应性，有利于种子在逆境胁迫下更好的吸收水分［6］。

龙胆草属于药用植物，其药效成分主要是次生代谢产物。环境胁迫能够显著影响药用植物的次生代谢等指标，虽抑制了植物的生长发育，但也会促进其次生代谢产物的分泌。有研究分析了苍术根际区土壤养分的变化规律，发现道地药材茅山苍术在生长发育过程中受到了较严重的养分缺乏胁迫，主要表现为缺钾胁迫［8］。与水分充足时相比，万寿菊在受到水分胁迫时，自身所含酚类物质含量明显增高［9］。何丙辉等研究发现，干旱胁迫促进了银杏中槲皮素含量的提高，抑制了芦丁含量的增加［10］。本研究得出结论，粗糙龙胆种子极其不耐盐但可以抵御一定程度的干旱胁迫，干旱胁迫环境对龙胆中主要药效成分环烯醚萜苷类的累计是否有促进作用，还需要进行下一步的试验证明。

［1］国家药典委员会.中国药典［S］.北京：中国医药科技出版社，2015：96.

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［4］郑伟，王彬，蔡永强，等.NaCl胁迫对火龙果种子萌发的影响［J］.种子，2008，27（1）：8284.

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［6］陈培，汪强，赵莉，等.水分胁迫对芝麻种子萌发特性的影响［J］.种子，2012，31（4）：8385.

［7］塔依尔，张凤华，周建文，等.盐胁迫对乌拉尔甘草种子萌发的影响研究［J］.种子，2010，29（7）：2129.

［8］郭兰萍，黄璐琦，邵爱娟，等.苍术根际区土壤养分变化规律［J］.中国中药杂志，2005，30（19）：1 5041 507.

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［10］何丙辉，钟章成.不同环境胁迫下银杏构件种群药用成分变化的研究［J］.西南农业大学学报，2003，25（1）：710.