弹性蛋白酶的研究进展及其在食品中的应用

郭卓钊，陈 宇，黄妙云，郭美媛，白卫东，刘晓艳

0 引言

弹性蛋白酶（EC3.4.4.7，Elastase） 是一种含有丝氨酸的肽链内切酶，其对甘氨酸、丙氨酸残基具有很高的水解特异性。由于弹性蛋白中甘氨酸、丙氨酸含量达55%以上，故弹性蛋白酶能高效水解由丙氨酸、亮氨酸等非极性氨基酸残基交联而成的具有网状结构的不溶性弹性蛋白（Elastin）[1]。弹性蛋白酶具有抗动脉硬化、改善脂类代谢的作用，可以作为防止动脉粥样硬化，治疗高血脂症、脂肪肝的生化药物[2]，疗效确切、安全可靠。同时，其高效水解弹性蛋白特性又可在食品工业中作为嫩化剂，在日用化工中作为洗涤剂等，具有广阔的应用前景及较高的商业价值。

1 弹性蛋白酶的分布与来源

弹性蛋白酶主要分布于动物及一些微生物中，某些植物中也可能具有弹性蛋白酶活力物质。

1.1 动物源

弹性蛋白酶在动物体内主要存在于动物的胰脏中，由Balo J等人[3]在1949年最先分离纯化得到，其含量可能与动脉粥样硬化症有关[4]。

目前的研究表明，哺乳动物（包括人）、昆虫和鱼等的细胞中都有弹性蛋白酶的存在。哺乳动物（包括人）中，弹性蛋白酶主要存在于动物的胰脏、脾脏细胞中；另外，动物的其他组织里也都有一定量的存在，如皮肤、皮下细胞、主动脉、巨噬细胞、淋巴细胞、白细胞、血小板、白血球等。已有报道分别从哺乳动物猪[5-6]、鼠[7]和羊[8]的胰脏中分离纯化得到弹性蛋白酶结晶，并对其进行了分子量及功能测定、动力学及性质分析。在某些昆虫的幼虫体内也曾分离得到弹性蛋白酶[9]。

有关鱼类弹性蛋白酶的研究比较少，主要集中在国外。其中，非洲肺鱼[10]、鳃鱼[11]、鲤鱼[12]、金枪鱼[13]、角鳖[14]、虹蹲鱼[15]、大西洋鳍鱼[16]和蛙鱼[17-18]等鱼类的胰弹性蛋白酶的纯化和鉴定工作已有研究和报道。来源于不同动物的胰弹性蛋白酶的水解效率有一定差别，通常情况下，来自于鱼类的胰弹性蛋白酶的水解效率比来自于哺乳动物的弹性蛋白酶高[19]。

1.2 微生物源

1960年，Mandl I等人[20]首次从黄杆菌-Flavobacterium elastolyticium中分离得到微生物源的弹性蛋白酶，该菌是从牙周病患者的送检样品中分离，能产生专一降解弹性蛋白的胞外蛋白酶。1974年，Shioo I等人[21]筛选出134株产弹性蛋白酶的菌，分别属于假单孢杆菌属（Pseudomonas sp）、芽孢杆菌属（Bacillus sp）、黄质菌属（Flavobacterium sp）、链霉菌属（Streptomyces sp）、节杆菌属（Arthrobacter sp）、无色细菌属（Achroobacter）、微球菌属（Micrococcus sp.）。

1975年，Morihara K[22]报道了多种芽孢杆菌可以产弹性蛋白酶。之后的研究表明，细菌、酵母菌、霉菌、放线菌中都有产弹性蛋白酶能力的菌株[23]。

目前，研究较多的产弹性蛋白酶的酶学特性的菌株有嗜碱芽孢杆菌（Bacillus alkalophilic）[24]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[25]、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[26]、 假 单 胞 菌 （Pseudomonas sp.）[27]、芳香黄杆菌（Flavobacterium odoratum）[28]、地衣芽孢杆菌 （Bacillus licheniformis）[29]等菌株。

1.3 其他

利用分子生物学技术克隆基因构建产弹性蛋白酶工程菌株，是今后弹性蛋白酶的研究热点，目前在国内外已有所报道。

宋笛等人[30]从芽孢杆菌中克隆得到弹性蛋白酶并命名为TX1，并连入pEAZY E1载体，构建了原核表达载体pEAZY E1-TX1。重组质粒导入大肠杆菌BL21后，经IPTG诱导基因表达。表达产物经Ni柱纯化后通过pH-stat测定其制备大豆肽的水解能力。序列分析结果表明TX1基因长度为1 143 bp，与Genbank上已报道序列（JQ305692.1） 同源性最高为99.48%，产生的碱基突变不影响其氨基酸编码。蛋白表达分析结果表明，当IPTG浓度为0.3 mmol/L，诱导4 h蛋白表达量最高。经SDS-PAGE和Western分析结果表明，经Ni离子亲和层析纯化获得量大小为39.4 ku的弹性蛋白酶His-TX1。

谷新晰[31-32]以1株产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 基因组 DNA为模板，经PCR扩增得到的铜绿假单胞菌弹性蛋白酶（P.aeruginosa elastase，PAE） 基因，与GenBank中的序列对比发现同源性为99%。成功地构建了重组表达载体pPIC3.5K/PAE，重组质粒Sac I线性化后转化毕赤酵母（Pichia pastoris） 菌株KM71中，通过PCR和表型鉴定表明，PAE基因已经整合到毕赤酵母染色体上。经大量筛选获得48株含高拷贝的重组毕赤酵母转化子。在甲醇诱导下，经过毕赤酵母高密度发酵进行PAE的表达，经SDS-PAGE分析，结果表明，在培养基上清中含有一明显特异性蛋白条带，大小为34 kD活性检测结果，酶活为1 060 U/mL，是出发菌株的26倍。

2 弹性蛋白酶的性质

弹性蛋白酶一般为白色针状结晶或淡黄色、深黄色粉末，也可以是浅褐色或褐色液体，有吸湿性，溶于水，不溶于乙醇[33]。

弹性蛋白酶的来源不同，其酶的氨基酸组成和部分结构、分子量也不一定相同。由动物胰脏提取纯化的弹性蛋白酶分子量为24～29 kDa，如中国鲎胰弹性蛋白酶相对分子量为28.5 kDa，鼠29 kDa，牛29 kDa，绵羊25 kDa，鸡25 kDa，大西洋鳕鱼24.8 kDa[34]，大西洋鲑27 kDa[35]。由微生物提取的弹性蛋白酶其分子量从21 000～39 500，如枯草芽胞杆菌蛋白酶subtilisin的分子量为31 kDa[36]。

作为同功不同源的蛋白质，不同来源的弹性蛋白酶作用也不相同。一般来讲，胰弹性蛋白酶不但能降解其天然底物——弹性蛋白，而且对除毛发角蛋白以外的大多数蛋白，如酪蛋白、胶原蛋白、白蛋白、血纤维蛋白、血红蛋白等都具有水解特性。而不同微生物来源的弹性蛋白酶，其分解底物的特点是不同的。有的微生物源弹性蛋白酶只能降解弹性蛋白，有些却具有较广的水解特性。即使是同一菌种，但来自不同地区的，所产生的弹性蛋白酶可能有完全不同的水解底物的特性。

多数弹性酶蛋白的等电点较高（5.7～10）[37-38]。胰弹性蛋白酶的最适pH值与最适温度一般与人体接近，而微生物产生的弹性蛋白酶最适pH值和最适温度稳定范围要比一般的蛋白酶高，目前研究发现其在中性偏碱性范围内具有较高的活性，最适pH值最高值是9.0，最适作用温度在50～60℃，耐受温度的最高值达70℃[39-40]。

3 弹性蛋白酶在食品中的应用

食品加工过程中，许多动、植物蛋白质，特别是韧带、大动脉血管、筋腱等含胶原蛋白和弹性蛋白较高的物质往往由于硬度及韧度较高而较难利用。弹性蛋白酶可以高效水解硬度及韧度高的弹性蛋白和胶原蛋白，使其口感变好，因此在农副产品深加工、罐头加工、高蛋白质食品的制作等方面将会得到广泛应用。

肉类加工中常会采取一些物理或生物的嫩化方法，使肉制品获得较好的嫩度。其中，对于外源酶法，最常用于肉类嫩化的酶主要是从菠萝、木瓜和无花果等植物果实中提取的蛋白酶。弹性蛋白酶也可以作为嫩化剂应用于肉类工业。韩建春等人[41]发现，通过弹性蛋白酶溶液浸泡，可以提高猪肉的嫩度。弹性蛋白酶的添加使牛主动脉的组织纹理打破，出现断裂和孔隙，可以使牛主动脉的韧度下降。李益恩等人[42]采用0.001%弹性蛋白酶作为嫩化剂，结合0.25%复合磷酸盐与工程法速溶调味料溶液注射及真空滚揉技术，获得嫩化卤牛肉的新工艺，缩短了牛肉卤煮时间，提高了牛肉的持水性，使卤牛肉嫩度大幅度提高。

常用的肉类嫩化剂，如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或无花果蛋白酶等，在酶解时经常会出现肌肉过度水解，而坚韧的结缔组织中的胶原和弹性硬蛋白没有作用的情况。由于弹性蛋白酶能够高效地水解硬度和韧度较高的结缔组织中的胶原和弹性硬蛋白，且会优先水解弹性蛋白[43]，达到肉类软化而又不过度水解的目的。刘书亮等人[44]研究表明，对于弹性蛋白、明胶、干酪素、牛血清白蛋白5种不同蛋白质及牛肉、牛肚、牛筋、猪肉和猪皮5种肉类蛋白质，不同来源的弹性蛋白酶可以对其进行不同程度的水解，木瓜蛋白酶也能降解弹性蛋白外的其他蛋白质。弹性蛋白酶处理的肉类样品的嫩度明显优于木瓜蛋白酶处理的肉类样品。关国雄等人[45]的研究表明，具有相同酪蛋白水解活力的弹性蛋白酶对于坚韧的牛胃肌、牛筋键等效果尤佳，而木瓜蛋白酶对坚韧肉类蛋白的消化能力较差。刘鹭[46]对弹性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解能力进行了对比。结果表明，对于卵白蛋白、明胶、大豆分离蛋白、牛血清白蛋白，在相同的酶活力下，弹性蛋白酶水解卵白蛋白的能力较高，而对其他蛋白的水解能力较低；对于弹性蛋白，弹性蛋白酶对其不仅有优先水解的能力，且水解能力较强，而木瓜蛋白酶对其无水解能力；对于弹性蛋白含量丰富的牛胃、猪皮及纯的弹性蛋白样品，弹性蛋白酶的水解能力是木瓜蛋白酶的20多倍。猪皮和牛肉经过弹性蛋白酶处理后，其剪切值都远远小于未经处理或用木瓜蛋白酶处理的样品，弹性蛋白酶处理的样品的嫩度明显优于木瓜蛋白酶处理的样品。也就是说，当弹性蛋白与其他蛋白质共存时，由于弹性蛋白对酶具有强亲和力，使得酶对弹性蛋白优先水解。因此，相对于其他蛋白酶，弹性蛋白是一种更为理想的肉类嫩化剂，在食品业中有着广泛的应用前景。

弹性蛋白酶也可以作为益生菌保健食品的促菌剂[47]及婴儿食品的强化剂[48]等应用于食品工业。杨远帆等人[49]应用弹性蛋白酶提取牛蛙皮胶原蛋白，使牛蛙皮胶原蛋白的提取率达到47.7%，表明弹性蛋白有良好的应用前景。

4 弹性蛋白酶利用前景及存在的问题

在我国，从猪胰脏中提取弹性蛋白酶是获取弹性蛋白酶的主要途径，但该方法由于原料（猪胰脏）的来源有限，而且酶的含量不高（每1 kg鲜胰脏含弹性蛋白酶仅210 000 U），造成酶的获取成本较高[50]，制约了弹性蛋白酶的生产。而利用微生物分泌胞外酶的方法生产弹性蛋白酶，该培养条件简单、生产周期短，容易实现大规模生产，且酶的提取纯化较容易，因此具有较好的发展前景。但是利用微生物生产弹性蛋白酶还存在一些问题需要解决。

（1）目前的报道表明，分离得到的弹性蛋白酶产生菌株大部分都具有致病性，对人体存在着潜在的危害，制约着其在商业上的应用。例如，目前报道的产酶菌株中主要是铜绿假单孢菌（Pseudomonas aeruginosa)[51]、产吲哚金黄杆菌（Chryseobacterium indologenes） 等[52]。

芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）具有生物安全性较高的特点，因而常作为工业酶制剂生产菌株。国内的王金英[53]、陈启和[54]及张娟等人[55]均筛选出产弹性蛋白酶的枯草芽孢杆菌，因此，枯草芽胞杆菌是潜在的工业化生产弹性蛋白酶菌株，受到普遍关注，但枯草芽胞杆菌的酶活都比较低。

（2）多数微生物生产的弹性蛋白酶的活力不高。殷文静[33]从肉联厂附近的土壤和污水中分离得到了19株能分泌胞外弹性蛋白酶的假单胞菌属菌株，但只有3株产酶活力超过15 U/mL。詹莉[48]筛选的209株产弹性蛋白酶的菌株中，酶活力最高的菌株SCELOI的酶活力只有33 U/mL，经诱变改性后达到45 U/mL。现有的报道中，酶活较高的是嗜碱菌Bacillus sp.XE22-4-1，该菌由中国科学院微生物研究所从西藏天然碱湖中筛选得到，其酶活力达300 U/mL[56]。2016年，舒会[51]从深海海泥中筛选得到1株蛋白酶耐盐稳定性好的深海铜绿假单胞菌，酶活力可达750 U/mL，是目前报道的产弹性蛋白酶最高的菌株。

（3）对微生物来源的弹性蛋白酶的结构研究较少，其构成及结构尚不明确。目前的研究发现，来自胰脏的弹性蛋白酶和来自铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）的弹性蛋白酶都不只含有1个酶组分，铜绿假单胞菌RAKS-I产生的弹性蛋白酶至少由2个酶组分构成[57]。人体中性弹性蛋白酶其一级结构是由218个氨基酸残基构成，该蛋白质结构包含2个由Asn连接的碳氢链，由4对二硫键连接起来。其反应性丝氨酸附近的氨基酸残基排列顺序为-Gl-Asp-Ser-Gly-[58]。

王超等人[59]发现，枯草芽胞杆菌弹性蛋白酶subtilisin的三维结构含有6个α-螺旋，7个扭曲的平行β-折叠以及2个反平行的β-折叠，His，Asp和Ser是其活性中心的关键基团。但其他微生物产的弹性蛋白酶的结构尚不明确。

（4）弹性蛋白酶一般不能在低温和酸性条件下应用。弹性蛋白酶最适水解温度一般在50～60℃，这个最适温度不利于肉类的防腐保鲜，这使得普通的弹性蛋白酶在肉类工业中的应用受到极大的限制。

低温型弹性蛋白酶在较低温度下酶活仍较高，能在25℃左右水解弹性蛋白，同时较低的温度可抑制肉类腐败菌的生长，因此低温型弹性蛋白酶在肉类工业中的应用比普通的弹性蛋白酶更具有前景及优势。樊陈等人[60]成功筛选出1株高产突变菌株XZU21，其最大产酶量160.3 U/mL，最佳反应pH值9.5，温度20℃，比原始菌株低5℃。高兆建等人[61]筛选得到弹性蛋白酶最适作用温度25℃，在40℃以下保温2 h，酶稳定性好。

弹性蛋白酶在酸性条件下活性较低,限制了其应用范围，需进行改性研究。孟喜龙等人[62]采用2种化学修饰剂对弹性蛋白酶进行修饰，修饰后的酶与未经修饰的酶相比，2种修饰酶活性均能保留在原酶的60%以上，用MPEG修饰酶的保留活性更高（85.5%），而且2种修饰酶在耐热性、耐酸性等方面都优于天然酶。

（5）微生物弹性蛋白酶的合成、分泌和调控机制还不明了。要生产及利用微生物来源的弹性蛋白酶，最关键的问题就是要获得无毒的能高产弹性蛋白酶的菌株，并利用优化培养条件及诱变等一系列方法使得菌株的酶产量更高。与此同时，在弹性蛋白酶的合成机制方面，分泌和调控机制等方面还要进行深入的研究，缩短其进行药理、毒理及药效试验的时间，从而进一步扩大弹性蛋白酶在医药、化工、食品等各个方面的应用。但目前，该方面的研究结果还不明了，阻碍了生产及应用微生物源弹性蛋白酶的进展，延缓了微生物弹性蛋白酶的研究与应用。

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