生物制品冻干保护方法研究进展

田烨，吴明媛



生物制品冻干保护方法研究进展

田烨，吴明媛

200010 上海交通大学药学院

随着生物技术的发展，越来越多的生物制品以冻干粉针的剂型被不断研究出来并应用于临床。虽然冷冻干燥技术应用于生物制品具有许多优势，但同时生物制品在冷冻干燥的过程中也容易发生变性导致药物效价降低。在技术上为了降低冷冻干燥对生物制品的不良影响，往往采用添加辅料或者优化冻干工艺这两种方法。本文综述了可提高生物制品稳定性，应对或降低生物制品变性的冷冻干燥技术的最新研究进展。

1 冷冻干燥的原理及过程

冷冻干燥技术是将液态的药液降温冻结成固体，然后在真空环境下进行升华干燥以除去冰晶，升华结束后同样于真空环境下进行解析干燥以除去结合水[1]。药物冷冻干燥的过程主要分为 4 个步骤：预冻、升华干燥（一次干燥）、解析干燥（二次干燥）、密封保存。依照上述步骤冻干后的药品可以室温或冷藏进行长期储存，需要使用的时候，添加合适的溶剂复溶后，便可恢复到冻干前的状态。而生物制品在上述冷冻干燥及保存的过程中都有变性的可能。

2 改善冻干生物制品变性降解的措施

为应对或减少生物制品在冻干过程及长期保存中的变性，通常会采用两种方式，即在处方中添加保护剂和优化冻干工艺。

2.1 添加保护剂

冻干保护剂是冻干制剂中的一种添加剂，能够减少或阻止冷冻干燥过程对蛋白造成的变性影响。根据冻干冷冻过程和干燥过程对蛋白质施加应力的不同，将蛋白质保护剂的作用机制分为冷冻保护机制和干燥保护机制。冷冻保护机制主要是优先化理论，保护剂优先从蛋白质表面进入溶液中，能在冷冻的过程中发挥保护蛋白质的作用。干燥保护机制主要有玻璃态假说和水替代假说。玻璃态假说指在干燥过程中，由于添加了保护剂，随着水分减少，溶液浓度逐渐增大而形成高黏度的玻璃态从而阻碍了蛋白结构的变化。水代替假说[2]是指在干燥过程中随着蛋白质水化层中水分失去，保护剂代替水与蛋白质重新形成氢键，从而满足蛋白质表面带电基团形成氢键的要求，使蛋白质结构得到稳定。

保护剂的种类很多，主要包括糖类、多元醇类、氨基酸类、高分子类、表面活性剂等。实际工作中通常根据生物制品的冻干变性特性添加一种或多种保护剂。

2.1.1 糖类 糖类是最常见、使用最广泛的一类冻干保护剂，是蛋白质的非特异性稳定剂。在冻干各个阶段均能起到一定的保护作用[3]，在预冻阶段，糖类增加了蛋白质的自由能而抑制蛋白的变性。而在干燥阶段，糖类可以取代由于脱水失去的蛋白质和水分子之间的氢键来稳定蛋白质[4]。常用的是二糖，主要包括海藻糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和甘露糖等，而蔗糖和海藻糖又是最常用的二糖。

蔗糖化学性质稳定，多呈无定型结构，对于冻干过程中阻止蛋白质二级结构发生改变以及长期储存中蛋白质的伸展和聚集起到显著作用，同时蔗糖也有一个相对较高的玻璃化转变温度（Tg），使得在冷冻状态下与蛋白质共浓缩，起到了稀释蛋白质的作用，从而防止多聚体的产生，并且维持蛋白质分子结构。另外蔗糖上的羟基能够替代部分结构的水，与蛋白质中的羰基和氨基结合形成的氢键使其在缺水的条件下仍然能够保持原有的结构，而不丧失活性[5]。Davis等[6]对蔗糖于冻干 lgG1 处方中稳定性影响做了研究，处方中含有不同浓度的蔗糖冻干制剂复溶后其 MFI 结果表明，未加入蔗糖的处方中的亚可见颗粒含量非常高，蔗糖的添加（蔗糖:蛋白最高添加至 2:1）显著降低了亚可见颗粒的数量，而添加少量的山梨醇（蔗糖量的 5%）进一步降低了亚可见颗粒的水平。冯强等[7]对抗人肝癌单抗片段 HAb18 F(ab')2的冻干工艺研究发现，蔗糖相对于葡萄糖、甘露醇等保护效果更佳，而且在复溶后的片段抗体在标记率及标记后 4 ℃放置的时间等方面均较未添加蔗糖的对照品有所增加，其原因可能是水替代假说理论。同时使用含蔗糖的抗体溶液进入玻璃化状态，更有利于保持抗体的生物活性。在冻干制品保存过程中，冻干制品不断吸收环境中的水，导致残余含水量逐渐升高，从而使得制品的 Tg 降低，当 Tg 低于环境温度时，可能引起生物制品变性。为了延长保存时间，可以选用蔗糖或者海藻糖作为保护剂提高制品玻璃态转变温度。王智等[8]对载氧药物的冷冻干燥和冻干制品的保存稳定性研究发现，在 P-PolyHb 溶液的冷冻干燥中，当蔗糖/蛋白质比率为 0.5 时得到的冻干制品 MetHb 含量为（5% ± 1.0%），但在室温下保存 3 个月，含水量增加，MetHb 含量上升至 15%，当蔗糖/蛋白质比率为 1.0 时，冻干制品在室温下保存 3 个月，含水量基本不变，MetHb 无明显增加，其他各项指标无明显改变。因此可见，蔗糖含量的增加提高了对生物制品的保护作用。

相对于蔗糖来说，海藻糖用作保护蛋白质效果更好，这是因为海藻糖的玻璃态转化温度相对更高，而且更不具有还原性。此外，海藻糖还有一些优点：吸水性小；自身分子内部不形成氢键而有利于与蛋白质形成氢键；低的化学反应性[9]。因此在许多药用蛋白的冷冻干燥配方中使用海藻糖。何晖等[10]对胞内海藻糖对红细胞冷冻干燥保存效果影响的研究表明，孵育后的红细胞冻干回收率随着海藻糖浓度的增加而增加，胞内海藻糖在冻干过程中对红细胞有保护作用。王辉等[11]研究表明，海藻糖对冻干胸腺肽生物活性作用保护的研究中，海藻糖在规程规定的范围内，显著延长了胸腺肽活性的保留时间，同时使得冻干胸腺肽热稳定性增强。

糖类对于蛋白质的保护作用与其浓度有关，通常在某个浓度范围内，糖的保护作用随着浓度的升高而增大，当达到某一浓度时，保护作用达到最大值，此时再增大糖的浓度保护效果无显著增加。Costantino 等[12]研究发现，当甲基 α-D-吡喃甘露醇、乳糖、海藻糖、纤维二糖与重组人生长激素的摩尔比例为 131:1 时，均能提供最佳的保护效果，当摩尔浓度达到 300:1 时，糖对重组人生长激素的保护作用不再提高，在某些配方中保护作用甚至有所下降。

2.1.2 多元醇类 多元醇类主要包括甘露醇和聚乙二醇等，这类物质在冻干制剂中常作为填充剂使用，但是对生物制品冻干过程也有一定的保护作用。甘露醇具有低温保护、容易成型以及形成的共晶物熔化温度高（Tm= –5 ℃）等特性，常被用于冻干药品低温保护剂[13]。周超和李素霞[14]对重组猪胰蛋白酶冻干制剂稳定性研究及细胞培养中的应用研究表明，3% 甘露醇是 rPT 理想的冻干保护剂，对于酶活性保留率达 81.3% ~ 101.0%，而未加保护剂的为 77%。石晶等[9]对重组碱性成纤维细胞生长因子保护剂研究中发现，当使用 3% 右旋糖酐、1% 甘露醇、1% 聚乙二醇 4000 作为保护剂时得到的冻干制剂更为安全稳定。其中甘露醇除了对 bFGF 蛋白质分子非极性表面有很好的稳定作用外，还能诱导蛋白亚基的自我聚合并具有减轻器壁吸附和防冻作用。聚乙二醇作为多聚物的保护剂，既有疏水性又有亲水性，适合于稳定 bFGF 类单分散状态的非均质蛋白质。

2.1.3 氨基酸类 氨基酸类主要包括甘氨酸、组氨酸、精氨酸、色氨酸等。这类物质除了作为 pH 调节剂防止因 pH 变化导致变性外还有阻止处方中缓冲盐的结晶而稳定蛋白的作用。Mattern 等[15]研究发现，在冷冻过程中，低浓度的甘氨酸可以通过抑制 10 ~ 100 mmol 磷酸缓冲盐结晶所致 pH 值的改变而阻止蛋白质变性。具有晶型的甘氨酸能够提高产品的塌陷温度从而保护蛋白质结构。而无定型的甘氨酸能够阻止冻干过程中蛋白的聚集。Lale等[16]对氨基酸类在冻干过程中的保护作用进行研究，无保护剂的过氧化氢酶在冻干过程中有 65% ~ 78% 的损失。在配方中加入氨基酸，过氧化氢酶在冻干过程中稳定性有显著提高，加入精氨酸和组氨酸后损失降至 10%，加入丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、4-羟基脯氨酸后，损失降至 5% 以下。

2.1.4 高分子化合物 高分子化合物中经常被用到的冻干保护剂是血清白蛋白，它既可以作为冷冻保护剂也可以用作干燥保护剂，对蛋白的保护效果已经得到研究的认可。但是因其可能含有病原体，阻碍了它的应用。现在一般用重组人白蛋白代替血清白蛋白作为蛋白质保护剂。此外，还有一些其他高分子化合物被用作保护剂，如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮（PVA）、羟乙基纤维素、明胶等。研究表明，二糖和高分子相结合对药用蛋白保护效果更好。例如含有二糖和羟乙基淀粉混合物的重组人白介素-11 冻干样品和仅含二糖或羟乙基淀粉的样品相比冷冻干燥后活性保留高[17]。

2.1.5 表面活性剂 表面活性剂对冻干过程中蛋白质的保护作用通常被认为是表面活性剂限制了在各种潜在的变性界面的蛋白吸附，如冰-液体、液体-空气、瓶-液体[18]。Zhang 等[19]发现一些表面活性剂的加入，如 0.1% 和 0.5% Tween 20，能够降低角化细胞生长因子和白介素-2 于复溶后产生的聚合物。而非离子表面活性剂如泊洛沙姆对于降低白介素-2 复溶后聚体产生没有显著影响。Chang 等[20]研究表明，处方中添加 0.1% Tween 80 减少了白细胞介素-1 受体拮抗剂的聚集。在处方中加入 0.02% 或 0.1% Tween 80 后同样有效抑制了牛 IgG 的聚集。Jones 等[4]对蔗糖或 Tween 20 对 anti-L-selectin 抗体的影响进行了研究。结果表明，处方中加入蔗糖和 Tween 20 可在复溶后明显降低聚体产生，而在未加入蔗糖而仅加入 Tween 20 的处方中复溶后聚体反而增加。

2.2 优化冻干工艺

通过优化冻干工艺，生物类制品在冻干过程及保存期间的稳定性同样也能够得到一定的改善。主要可优化的步骤为预冻、第一步干燥、第二步干燥（解析干燥）。

2.2.1 预冻的工艺优化——控制冰晶大小 根据生物制品的变性机制，在预冻过程中控制冰晶的大小是改善生物制品稳定性的主要方法之一。Geidobler 等[21]通过控制冰晶大小的不同制备了牛血清白蛋白和某单克隆抗体的冻干制剂并比较其稳定性。发现通过快速冷冻即预先冷冻隔板的方法制备过程中冰晶较小，第一步干燥时间较长，同时制备的冻干粉比表面积较大。而通过控制冰晶即缓慢降温并增加退火步骤，制备的冰晶较大，第一步干燥时间缩短，且制备的冻干粉比表面积较小。而快速冷冻的方法制品中水分残留（0.2% ~ 0.4%）虽然小于控制冰晶的方法（0.5% ~ 0.8%），但由于两者水分残留都较低，对冻干制品并无本质差异。通过控制冰晶大小的方法缩短了干燥时间，间接提高了稳定性，且由于比表面积较大，复溶的时间也大大缩短，这两点都有助于提高生物制品的稳定性。而 Beech 等[22]用 4 种不同冷冻方法（慢速降温、慢速降温+ 退火、快速降温、快速降温+ 退火）对不同浓度的牛血清白蛋白和某单克隆抗体做出进一步研究，通过外观（扫描电镜）、表面积、复溶时间等各个方面进行了对比，其研究结果表明，低浓度的生物制品在快速降温的方法中复溶时间明显增加，这与其冻干后开放的网状结构和球形大孔有关。而对于高浓度生物制品其结果显示不同冷冻方法复溶时间无显著差异，这就说明低浓度制剂改善外观和复溶时间可通过控制冰晶大小，优化预冻工艺来实现。

2.2.2 第一步干燥——改变干燥温度 第一步干燥是整个冷冻干燥过程中耗时最长的步骤，同时也是最复杂的步骤。其工艺受到产品本身性质、温度、压力以及内包材性质等各个参数的影响。第一步干燥理想的状态为在合理的温度下让其尽快升温至平衡温度，且尽可能地缩短平稳温度时间。由于其复杂性，本文不对其展开讨论，仅对生物制品的特殊性进行讨论研究。

生物制品的处方中通常含有保护剂，如蔗糖或海藻糖等，这些保护剂冻结浓缩过程中具有较高的黏度。而高黏度的系统可以减低蛋白的变性率，这是因为理论推断和一些数据表明蛋白变性（去折叠）动力学和黏度之间存在关系，其公式为1/2= Aηα（1/2为蛋白去折叠的半衰期，A 为常数，η 为黏度，α 为耦合常数）[23]，因此在糖类系统中因为其黏度较大使得变性率变得很小，几乎可以忽略，甚至在热力学不稳定的温度下或高于 Tg 时干燥也不会导致蛋白变性。例如 65% 的蔗糖体系中，即使是在–15 ℃（高于 Tg 20 ℃）时其蛋白去折叠的半衰期为 1240 h，而干燥时间远远低于半衰期时间。因此在糖类等保护剂系统中，第一步干燥温度即使高于 Tg 也不会使蛋白发生变性。然而塌陷的情况仍然在此阶段有可能发生，一般加入一定量的填充剂，如甘露醇、甘氨酸，可以避免塌陷的发生。例如当处方中同时含有保护剂和填充剂，使得其塌陷温度接近于共熔温度，这样塌陷温度就明显高于大多数保护剂的 Tg，这就使得在第一步干燥的过程中可以将温度最高提升至共融温度附近，提高干燥效率。很多研究也报告了生物制品的第一步干燥温度可以高于 Tg 而不会导致其不稳定[24-25]。

2.2.3 第二步干燥——控制升温速率 第二步干燥是冷冻干燥的最后一个阶段，由于干燥初期产品中水分残留较高，通常为 5% ~ 20%，快速的升温可能会导致产品形状的坍塌。因此通常采用降低升温速率的方法来控制产品的外形，通常以 0.1 ℃/min 或 0.15 ℃/min 为升温速率，据 Tang 和Pikal[26]研究表明，这种慢速的升温方式是对产品质量较为安全的。这一升温速率同样适用于生物制品。而在高温维持一定时间以解析水分的过程中，对于温度及干燥维持时间的设定通常会考虑生物制品的特殊性，如蛋白类药物通常会考虑其变性温度，将冻干机隔板温度及干燥时间设定在蛋白不发生变性的条件下进行。对于真空度的设定，在小于26.7 Pa 时不同的设定对于第二步干燥来说是微乎其微的，因此通常会将第二步干燥的真空度与第一步保持一致。

3 结语和展望

随着生物技术的发展，冻干技术在生物制药行业的应用越来越广泛，应用该技术的同时需要根据不同的生物制品特性加入一些保护剂或者是优化冻干工艺以稳定其制品。伴随着冻干保护机制的研究逐步深入，冻干技术也在不断的完善和进步。但是对于生物制品例如蛋白的表征还需要更加深入的认知，稳定性机制还有待进一步深化。而对冻干工艺过程中的某些参数，比如压力、复溶后产品的结构表征和性质是否发生改变等报道甚微，还需要更深一步的了解。尽管面对诸多问题，但是冻干技术仍是保持生物制品稳定性的最有效方法。而开发更加优越的冻干保护剂，提高生物产品的质量是冻干技术的研究热点。

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田烨，Email：Reinhard0724@gmail.com

2017-11-20

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.01.015