光遗传学技术在中枢神经系统疾病中的应用进展

林夏妃，朱昭琼

(遵义医学院附属医院 麻醉科，贵州 遵义 563099)

中枢神经系统疾病在多方面影响人类的生存质量。目前中枢神经系统疾病的治疗方法有药物治疗、深部脑刺激技术(deep brain stimulation,DBS)等。但是药物治疗缺乏时间上的特异性，深部脑刺激术缺乏空间上的特异性，两者都不能同时兼备时间空间特异性的特点，不能精确地定位到靶细胞中。2016年，Towne和Thompson将光遗传学定义为一种使用光控制活体组织中细胞的方法，通常为表达了光敏蛋白的神经元细胞[1]。光遗传学技术为精确控制细胞功能提供了可能性。本文主要介绍光遗传学技术的基本原理，及其在中枢神经系统疾病诊断和治疗方面的应用进展。光遗传学(optogenetics)这一概念由Deisseroth等于2006年首次提出，并于2011年被《Nature Methods》杂志评为2010年度技术[2-3]。

1 光遗传学技术

光遗传学技术的主要特点是光学与遗传学相结合，通过光来控制神经元的生物学功能[4]。光遗传学技术主要由三部分组成：即光敏蛋白、运载体以及光刺激系统。光遗传学技术是通过病毒运载体将光敏蛋白表达于靶细胞膜上，通过光照来实现对细胞功能的精细调控。

1.1 光敏蛋白 光敏蛋白是一种跨膜蛋白，其在特定波长光照射下，引起离子跨膜运动。光敏蛋白主要以视紫红质通道蛋白2(Channelrhodopsin-2,ChR2)和嗜盐菌紫质(Halrohodopsin,NpHR)为代表。前者为钠离子通道，可通过蓝光照射使细胞膜去极化引起细胞兴奋；后者为氯离子泵，通过黄光照射使细胞膜超级化抑制细胞的兴奋性[5]。近年来，还发现了视蛋白嵌合受体(OptoXRs)，是由视蛋白和G蛋白偶联信号组成，在光照下能引起细胞兴奋去极化[6]。Boyden等提出了两种新型通道蛋白，分别为能被红光激活的Chrimson和能被蓝光激活的Chronos，两者都可以调节特定神经元的活动，但Chronos比Chrimson对暗光更加敏感[7]。

1.2 光敏蛋白运载体 光敏蛋白基因被转运并稳定地表达于靶细胞中是光遗传学技术的关键问题。而光敏蛋白基因植入到靶细胞中，需要光敏蛋白运载体参与。光敏蛋白基因常用的运载体主要有两种，即病毒和转基因动物。常用病毒运载体有腺病毒、慢病毒[8]。腺病毒相关载体可以使基因表达在广泛区域中，而慢病毒相关载体可以使基因在靶细胞中较为长期而稳定地表达。目前已经成功构建表达ChR2和NpHR以及表达Cre重组酶的转基因小鼠[9-10]。可通过免疫荧光成像等技术检测光敏蛋白基因是否成功表达于靶细胞中。

1.3 光刺激系统 表达了光敏蛋白的靶细胞，需要光照才能被激活。在离体实验中，常使用的光源为发光二极管和过滤光。发光二极管包括卤素光源、氙气光源和微小发光二极管(LED)[11]。而在体内实验中，主要应用激光等过滤光，利用光导纤维，精确地将光束导入到所研究的大脑区域附近，虽然侵入性更强，但可更加详尽地了解大脑深部结构，为研究神经活动如何导致行为学改变提供帮助[12]。

2 光遗传学在中枢神经系统疾病中的应用与进展

2.1 光遗传学在癫痫中的应用 癫痫是由一组神经元过度同步性异常放电所引起的慢性脑部疾病，由中枢神经系统的兴奋性与抑制性失衡引起。目前癫痫的主要治疗方法为药物治疗，但仍有部分患者对药物治疗效果不理想，发展为药物难治性癫痫。传统的抗癫痫药物在癫痫神经回路中针对特定的细胞类型显示出欠缺的特异性。许多神经元在癫痫发作期间的过度兴奋是动态的，需要对神经活动进行精确时间控制以进行有效的治疗[13]。而光遗传学技术具有时间和空间上特异性，可以精准定位到一组或单个的神经元细胞中，能够进一步研究癫痫的发病机制。

Tonnesen和Skhotinsky分别在体外和体内诱导了癫痫模型，运用载体使NpHR基因表达于海马上，结果显示，通过黄光照射可以缩短癫痫的发作时间[14-15]。谷氨酸是神经系统中作用最广泛的兴奋性神经递质，体内浓度过高时神经元过度兴奋，易引起癫痫发作。体内谷氨酸维持正常的浓度主要靠星形胶质细胞的摄取[16]。有一部分患者由于星形胶质细胞的摄取功能障碍而发展成难治性癫痫，因此研究者选用星形胶质细胞作为靶细胞表达ArchT基因，减少神经元胞外谷氨酸浓度，成功抑制过度兴奋的神经元放电[17]。

深部脑刺激通过提高网状丘脑核γ-氨基丁酸(GABA)能抑制性神经元的强度，缩短癫痫的发作持续时间，表明丘脑是调节皮层癫痫发作的重要部位。通过在小鼠丘脑表达ChR2通道蛋白，用皮层电刺激诱发癫痫样发作，丘脑区域用蓝色光刺激，结果显示高频率(100赫兹)和长时间的光刺激，可以有效地抑制胼胝体诱发的癫痫样活动，表明在丘脑区的GABA受体可能参与抑制癫痫样发作[18]。

癫痫猝死(sudden unexpected death in epilepsy,SUDEP)是癫痫患者突然发生的一种致死性的并发症[19]。癫痫发作引起的呼吸骤停(Seizure-induced respiratory arrest ,S-IRA)是癫痫猝死的重要原因，而声刺激是诱发S-IRA发作的重要因素[20]。研究者利用光遗传学技术选择性激活小鼠的5-HT神经元，5-HT神经元刺激中脑背核(DR)，明显降低了声刺激诱发的癫痫发作引起呼吸骤停的发生率。研究结果表明，小鼠癫痫发作引起的呼吸骤停(S-IRA)与中脑背核(DR)的5-HT能神经元的神经传递有关，所以运用光遗传学技术预防SUDEP是有可能实现的[21]。

2.2 光遗传学在帕金森病中的应用 帕金森病(Parkinson's disease,PD)是由黑质多巴胺能神经元变性引起的好发于老年人的脑部疾病，临床表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓、姿势平衡障碍以及与之伴随产生的焦虑、抑郁、记忆力减退和各种自主神经症状。帕金森病目前主要通过药物治疗，包括左旋多巴、金刚烷胺等，但是药物治疗也产生许多副作用。近年来，深部脑刺激术也逐渐在临床中应用，但其缺乏空间特异性，不能精确地定位到靶细胞中。光遗传学的出现，能让我们从神经元及神经回路的水平上更深一步地了解帕金森病的发病机制以及对其诊断和治疗方面有新的认识。帕金森病主要病变区是黑质纹状体，故治疗帕金森病的运动障碍，纹状体是关注的一个主要区域。GABA能中等多棘神经元(medium spiny neuron,MSNs)是纹状体中主要分布的神经元，分为直接通路(direct pathway)上的MSNs(dMSNS)和间接通路(indirect pathway)上的MSNs (IMSNs)，构成直接通路和间接通路。Kravitz等研究表明，刺激间接通路会产生帕金森病样症状，出现冰冻行为和动作迟缓，而激活直接通路则可改善小鼠僵直行为和动作迟缓症状[22]。光遗传学技术允许在体内精确快速地激动纹状体，从而在一定程度上控制帕金森病症状。

α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)及其突变体是一个已知的与帕金森病直接相关的小型突触前蛋白，突变的a-Syn过度表达会导致多巴胺的释放减少，从而导致运动功能障碍[23]。研究者利用果蝇幼虫遗传模型来研究多巴胺释放减少是否会诱发帕金森病相关症状(即运动减慢等)。实验者敲除了果蝇多巴胺神经元基因，造成了果蝇幼虫的运动障碍。把表达ChR2的敲除了多巴胺神经元基因的果蝇，急性(1 min)和长时间(1～12h)暴露于波长为470nm的蓝光下，均可改善帕金森相关的运动障碍症状。实验结果表明，光激活ChR2可以改善由于多巴胺突触传递障碍引起的帕金森病症状[24]。

2.3 光遗传学在阿尔兹海默病及术后认知功能障碍中的应用 阿尔兹海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种起病隐匿，主要表现为进行性认知功能障碍和记忆力损伤的神经退行性疾病。了解AD的发病机制，可以预防或者改善AD的症状，改善老年人的生活质量。AD的发生与多种因素相关，如tau蛋白异常磷酸化、β淀粉样蛋白(Aβ)过度沉积、神经元凋亡、炎症反应及氧化应激等[25-26]。研究表明，活性氧可以激活Ca2+通道，大量Ca2+内流从而使Ca2+依赖性蛋白激酶与蛋白磷酸酶比例失衡，从而促进tau蛋白异常磷酸化，加速AD的发生[27]。

术后认知功能障碍(Postoperative cognitive dysfunction，POCD)的发病症状与AD的临床表现相似，都有学习及记忆力能力减退的症状。有研究表明全麻药物等围术期的因素可以从不同方面增加患者POCD的发生风险[28-29]。线粒体功能可受全身麻醉药物的影响，导致中枢神经系统神经元的损伤，不仅能够造成活性氧自由基(ROS)的积聚，还能促进内质网中Ca2+的释放，导致线粒体中Ca2+水平显著提高[30]。线粒体中的Ca2+浓度的增高可以引起线粒体内与细胞凋亡相关物质的释放，诱导神经细胞的凋亡[31]，从而造成POCD。吸入麻醉药通过激活GABA受体，抑制N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-articulatory acid receptor，NMDAR)而发挥中枢性麻醉作用，有研究表明吸入麻醉药影响老年大鼠的记忆能力可能与海马区NMDAR1表达下降有关[32]。因此，吸入麻醉药导致的POCD的机制可能与NMDAR受体有关。利用光遗传学技术激活体内被抑制的相关受体能否能改善大鼠的学习记忆能力还有待进一步研究。光遗传学技术的出现也许能让我们更深一步地了解POCD。

3 展望

大脑运动、感觉、认知功能取决于连接神经元和网络之间相互作用。故研究中枢神经系统疾病的发病机制要在神经元水平上才能更加精确。光遗传学技术兼具时间空间特异性的特点，能够在神经元以及神经环路水平上研究疾病的发病机制。光遗传学技术是研究大脑和行为之间联系的可靠工具，我们可以利用光遗传学这一特点，在现有的水平上更加深入地研究POCD。而功能性光成像技术和光遗传学的联合应用，可以从Ca2+水平方面进一步研究POCD的发病机制。

光遗传学技术现在面临的主要障碍是从实验室到临床的应用。光遗传学在检测和治疗疾病的过程中，一个关键环节是需要把光敏蛋白基因转入到患者体内并使其稳定的表达，目前主要面临以下几个问题：①在神经元表达光敏蛋白非侵入性的方法；②如何准确评估光敏蛋白在体内表达水平；③光敏蛋白是一种外源性蛋白抗原，患者自身存在对其的免疫反应该如何解决。尽管光遗传学在临床上应用仍有许多挑战，但仍可安全有效地运用于灵长类动物中[33-34]。在临床试验中腺相关病毒在患者体内成功注射，证明了其安全性[35]。因此光遗传学技术的产生，为研究中枢神经系统疾病的机制提供了新方法。