NAIT产前筛查研究进展

李宏洋,刘铁梅

(吉林大学中日联谊医院 输血科，吉林 长春130033)

1953年，两名婴儿出生时血小板严重减少，而母亲具有正常血小板计数。在Shulman的两个案例中，母亲特异性的针对于血小板同种异体抗原PlA1抗体的胎盘转移是新生儿血小板破坏的原因。后来由一位荷兰人发现PlA1与Zwa抗原是完全相同的，并且现在被称为“HPA-1a”[1]。在随后的几年中，出现许多其他能够诱导产妇在怀孕期间免疫并导致胎儿血小板破坏的血小板特异性抗原，据统计NAIT在高加索人中的发病率是千分之一。

1 发病机制

孕产妇的异源免疫主要来自于母亲的血小板抗原和胎儿从父亲那里继承来的血小板抗原的不相容。这种免疫通常在分娩第一胎不相容的胎儿后持续存在或者短暂存在[2]。母体IgG免疫球蛋白穿越胎盘包住胎儿血小板，除去胎儿网状内皮系统，导致潜在的严重血小板减少症。

2 NAIT相关抗原

血小板膜糖蛋白以双等位基因形式存在，其中一些具有免疫原性。在血小板特异性抗原的每个系统中，高频和低频的等位基因分别称为“a”和“b”。能够引发NAIT的抗原位于血小板上的膜糖蛋白(GPs)GPIb-V-IX(血管性血友病因子受体)，GPIIb / IIIa(αIIb/β3整联蛋白，纤维蛋白原受体)GPIa / IIa(胶原受体)和CD109，糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的不确定功能的蛋白质。总之，这些血小板GP与细胞外基质和凝血因子的蛋白质相互作用以促进止血[3]。遗传的多态性就是由于位于六种不同的糖蛋白(GPIIb，GPIIIa，GPIbα，GPIbβ，GPIa，CD109)上的至少27个单个氨基酸取代导致的，并且已证明是他们引起母体在怀孕期间免疫，导致NAIT[4]。

2.1 HPA抗原系统

NAIT涉及的第一种人血小板抗原是HPA-1a(最初称为P1A1)，来自PSI(凝集素-信号素-整联蛋白)位置33处同源结构域GPIIb / IIIa复合物的GPIIIa亚基(αIIb /β3整联蛋白)的亮氨酸/脯氨酸置换。母胎HPA-1a不相容是迄今为止在白种人和非洲血统家族中最常见的NAIT的原因，在鉴定了HPA特异性抗体的病例中约占85%[5]。超过90%的HPA-1a抗体是由于妇女DRB3*0101(DR52a)抗原阳性所致。这种相关性似乎与含有Leu33的GPIIIa肽与DRB3*0101的肽结合槽的高亲和力相关[6]。另外，HPA-1，-2，-3，-5和-15，也同样可以引起NAIT。

2.2 ABO抗原

已知血小板通常在其表面表达少量的A和B抗原。Curtis等人[7]证实在一些个体中，血小板A1和B抗原水平极高，范围高达每个血小板20000个抗原位点。因此如果与其母亲ABO不相容，则可能处于血小板减少症的风险中。

2.3 糖蛋白IV CD36

糖蛋白IV(CD36)是B类清道夫受体家族成员，在血小板，红细胞，内皮细胞和其他组织上表达的蛋白质。约5%的非洲或亚洲血统的人，突变导致CD36表达失败，如果通过输血或怀孕暴露于蛋白质则具有免疫的风险。临床上母亲针对于CD36免疫相关的NAIT的图片与受HPA特异性抗体影响的婴儿相似[8]。

2.4 HLA抗原

人血小板携带至少20000个I类HLA抗原拷贝，占循环血液中大多数HLA抗原，鉴于约三分之一的经产妇对I类HLA敏感，在一些新生儿中可能存在I类HLA抗体引起NAIT。只有10%的HPA-1b1b母亲对于胎儿HPA-1a将产生HPA-1a抗体。如果母亲具有DRB3 * 0101等位基因，则免疫的风险增加。30%的人口存在这种情况，而且它是HPA-1a多肽存在时产生同种抗体至关重要的[9]。缺少DRB3 * 0101几乎排除了同种异体免疫。

3 临床表现

NAIT的临床表现情况不一，出血征象包括：无出血，瘀点，血肿，胃肠道出血，血液渗出，血尿，视网膜出血和ICH。在前瞻性研究中，可以看到NAIT病例中较大比例是无症状的。而NAIT最严重的并发症就是ICH。ICH发生在15%的HPA-1a NAIT新生儿中并伴随着严重血小板减少(<50×109/L)，死亡率为15%[10]。因此孕妇产前HPA抗体筛查势在必行。

4 实验室诊断

4.1 血清学方法

免疫分析方法是抗体鉴定的主要工具，但并不是诊断的金标准。使用血小板作为靶细胞检测HPA抗体的方法，如单克隆抗体特异性固定化血小板抗原(MAIPA)试验，血小板抗原捕获(PAC)试验，间接血细胞凝集试验(MPHA)，流式细胞术分析，酶联免疫吸附测定(ELISA)和液相芯片串珠测定[11]。其中MAPIPA测定具有高度的敏感性和特异性。

4.2 基因检测

血小板基因分型才是血小板检测的金标准。HPA基因分型方法有序列特异性引物聚合酶链式反应(PCR-SSP)，变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)，限制性片段长度多态性分析技术(PCR-RFLP)，高分辨率熔点曲线的方法(HRM)，HRM即通过确定DNA的熔点达到检测目的。大多数情况下是通过替换C-G与A-T碱基对产生HPA多态性。HRM可以同时检测1至4个多态性，这有利于确定稀有HPA的频率[12]。另一种方法是荧光PCR反向序列特异性寡核苷酸探针技术，使用荧光杂交探针可以同时确定几个多态性[13]。

5 产前筛查

在通过妊娠检查以MAIPA检测同种抗体水平的研究中，随着妊娠次数的增加抗体水平降低，产后6周检测到最高水平的抗体。由于NAIT频繁影响第一次怀孕，因此使得ICH经常发生在产前，母体同种异体抗体对于预测胎儿的风险具有极大的价值。

同种异体抗体的特性和IgG的滴度可以有助于判断症状的严重性。抗体亚类的不同，补体活化能力，HPA抗体与吞噬细胞Fc受体结合的亲和力也不同。已有数据分析HPA抗体免疫球蛋白的亚类[14]。虽然证据表明IgG2不如IgG1和 IgG3那样有效的诱导吞噬和补体介导的细胞裂解，Kelsch指出IgG2能够引起血小板功能障碍并导致临床上显著出血，即使血小板计数正常[15]。IgG的核心岩藻糖基化的调节可能对疾病严重程度，HPA同种抗体的抗体依赖的细胞毒性作用产生深远的影响[16]。

Kapur等人表示母体内导致NAIT的HPA-1a抗原的特异性抗体，如果这种抗体缺乏核心岩藻糖，要比核心岩藻糖基化的抗体，吞噬已被抗体包被血小板作用更强[17]。Ferrara以及他的同事[18]，也发现了IgG分子的功能变化，缺乏核心岩藻糖残基的IgG分子与FcgRIII的亲和力更强，并表现出更强的细胞免疫功能，例如抗体依赖的细胞毒作用。研究显示在NAIT的血清中，核心岩藻糖的降低程度与NAIT的严重程度相关[19]。

6 展望

虽然NAIT是罕见的，但是它是良好状态新生儿中患有严重血小板减少症的最常见原因。由于人种不同HPA表型频率不同，国外的数据无法指导我国的情况，因此为弄清我国孕妇孕期同种血小板抗体的产生情况以及新生儿NAIT的发病情况和ICH的风险，以便我们实施针对性的预防措施。任何患有血小板减少症并且没有其他确定原因的新生儿，或者曾经生育过NAIT孩子的母亲再次怀孕时，父母的血液样本都应该进行NAIT测试。但是无论血清学方法还是基因检测都存在一定的缺点，那么为了准确的诊断NAIT，未来我们要不断的完善检测方法。如使用CHO和293T细胞，将编码特异性HPA的cDNA进行细胞转染技术。使用含有七种罕见的HPA与整合素β3肽的重组体，称为SuperRare的多肽类适合检测抗HPA抗体。肽适体，模拟HPA-1a抗原，被HPA-1a同种异体抗体识别具有非常高的灵敏度[20]。多能干细胞编码血小板表面糖蛋白基因的改变可以编码血小板特异性同种抗原，并且这种抗原会有效表达[21]。新型的基因编辑技术，产生表达低频的血小板特异性抗原的人类血小板的原始细胞。表达的蛋白与人类抗体相对应。通过使用这种技术，创造血小板祖细胞或血小板表达的其他临床上有显著意义的抗原，目前正在进行中。但是中国的NAIT的数据却不足，而正在开展的孕妇抗-HPA抗体致新生儿同种免疫性血小板减少症的多中心前瞻性队列研究[22]，预计将在中国提供NAIT的基础数据，并筛查出能够预测NAIT严重程度的具有中国特异性的抗体滴度。

作者简介：刘铁梅(1965-),女，博士，教授、主任医师，博士生导师，输血科主任，主要从事临床输血工作。

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