红曲霉产色素和桔霉素影响因素的研究进展

黄 娟，姚若一，黄邵培，刘思芬，邓 颖，王伟平

（湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北武汉 430068）

红曲霉是散囊菌目中的一属子囊菌曲霉科真菌，红曲霉利用各种碳源和氮源合成红曲色素、洛伐他汀、γ-氨基丁酸、桔霉素等代谢产物。红曲色素作为一种天然色素，被广泛的用于食品行业和化妆品中，红曲色素有广泛的生物活性，例如抑制细胞癌变、抗菌活性、清除活性氧和抗突变体等作用。而桔霉素具有肾毒性，可引起实验动物的肾脏肿大、尿量增多，肾小管扩张和上皮细胞变性坏死等，还可能诱发肿瘤，导致畸变、突变。桔霉素的存在大大限制了红曲色素的应用。因此，我们要找到高产红曲色素低产桔霉素的对策。

1 菌种及菌种改造

红曲色素安全性高、用处广，故当前很多科研人员对红曲色素的生产和研究产生了很大的兴趣，为得到高产红曲色素低产桔霉素的方法进行了一系列研究，而目前研究主要使用的菌种有：M.purpureus、M.ruber、M.fuligmosus，M.anka、M.rubigino-sus、M.bakeri、M.albidus和M.serorubescens[1]这8种，并以紫色红曲霉、红色红曲霉使用最为广泛。此外，还有部分科研人员所用菌种是直接从某些地方取材，类别没有进行鉴定。

传统的物理化学方法诱变可以提高色素产量，降低桔霉素产量。吕旭聪等[2]采用物理化学复合诱变（紫外诱变和氯化锂诱变）的方法得到了高产色素的突变菌；王轩等[3]通过紫外诱变和浓度为5%的硫酸二乙酯诱变后，分离筛选得到1株突变株G009-UV-D-9，该菌株与原始菌株相比较桔霉素含量降低了90%以上。

传统的物理化学诱变不能定向突变得到所需菌株，且耗时长，成功概率低。近年来研究者通过基因工程技术，如重叠延伸PCR技术，真菌次级代谢产物异源表达系统的构建等，在分子水平上对红曲霉基因进行一定的改造，从而降低桔霉素的产量，提高色素产量。柳燕[4]以福建红曲霉M-CL为出发菌株,通过重叠延伸PCR技术融合片段与带有潮霉素抗性的PSKH质粒，得到了理想的基因敲除菌株，较原始菌株桔霉素产量降低41.8%，色素产量提高11%。Sakai等[5]构建了桔霉素的异源表达系统,得到的菌株桔霉素产量也有所降低。

通过微生物混合发酵方法可以降低桔霉素的生成。研究显示将红曲霉与酵母菌或米曲霉共培养可以显著提高色素的产量，相比单培养，共培养可以使菌体质量增加2倍，色素产量增加30～40倍[6]。张建玲[7]在液态发酵时分别接入酵母菌和乳酸菌与红曲菌株混合培养，发现与单纯红曲菌株培养相比色素产量有所提高，桔霉素的产生也被抑制。

2 培养基

2.1 氮源

选择合适的氮源有利于色素生成。岳建明等[8]发现，以硝酸钙、硝酸钠、尿素为氮源时，发酵液呈红色；以氯化铵、硝酸铵、硫酸铵为氮源时，发酵液呈黄色。侯敏等[9]发现，以硝酸铵为氮源时，细胞内色素产量较高，而以硫酸铵为氮源时，细胞外色素产量较高。有机氮源比无机氮源更利于红曲霉色素合成[10]。

不同的氮源对于桔霉素的合成有不同的影响。甘氨酸、酪氨酸、精氨酸、丝氨酸和组氨酸，可以抑制桔霉素的合成，同时可促进红曲色素的产生，其中组氨酸的效果最好[11-12]。氮源为甲硫氨酸、尿素时，桔霉素的合成受到抑制[13]，但色素的产量也随之降低。而谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸作为氮源时，桔霉素的产量增加。

2.2 碳源

合适的碳源能够影响红曲霉色素的生成。侯敏等[9]的研究发现，红曲霉在以甘露醇、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及淀粉为单一碳源的发酵液中生长良好。杨成龙等[14]发现，碳源的添加浓度为4%～5%时，最适宜红曲霉S产色素，以甘露醇为单一碳源的色价最高，其次是大米粉，两者色调均偏红；葡萄糖与蔗糖的色调偏黄，但总色价偏低。

2.3 pH值

研究表明，培养基pH值能影响红曲霉菌的活性，从而影响产色[15]。王红等[16]的研究也发现：不同的初始pH值，会影响红曲霉的生长速度，从而影响色素的产量。偏酸环境有利于红曲色素的生成，色价也较高;在碱性环境下菌丝体基本不生长，色价也很低[17]。

不同pH值对红曲霉的发酵产物色价、桔霉素都会产生影响。有研究表明，碱性条件下可促使细胞内的红曲色素排出并且显著抑制桔霉素的产生[18]。也有研究显示，低pH值条件下的发酵可以得到不含桔霉素的产物，其色素合成并没有受到影响，反而比高pH值条件下的产量要高，并主要为胞内色素[19]。

2.4 金属离子

添加Fe2+能使培养基中色素的含量上升[20]。而加入某些金属离子能够影响桔霉素的合成，加入Mg2+色素的产量虽不受影响，但却促进了桔霉素的生成[21]，所以培养基中最好不要加入镁离子。而加入金属离子螯合剂乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraaceticacid，EDTA），可以螯合金属离子，能够抑制桔霉素的生成[6]。

3 培养条件

3.1 光照

光照作为外界环境改变的信号分子，可诱导包括丝状真菌在内的多种生物生长发育和次级代谢产物的改变[22]。因此深入了解光信号在真菌生长发育过程中的作用，对于研究包括红曲霉在内的非光合微生物的代谢具有重要意义[23]。

在红光照射培养条件下，红曲色素合成期持续时间更长，色素产量高于黑暗培养条件，同时在一定程度上减少了桔霉素的生成[24-25]。Wang等[26]研究发现，相比黑暗条件，蓝光条件下红曲色素增产28.5%，桔霉素减产79%，但在蓝光光照条件下红曲色素稳定性比较差。

3.2 温度

变温培养时红曲霉菌体生长缓慢，造成红曲霉产桔霉素量增加；恒温培养更适合菌体生长，并且能够激发菌体分泌色素[27]。苗玉志等[28]发现，菌株在不同的培养温度下生长和产红曲色素的能力不一样，最佳的生长温度为35℃，最适宜的产红曲色素温度为30℃。控制合适的发酵温度，可以有效降低液态发酵中桔霉素的生成[29]。许赣荣等[30]提出液态发酵的培养温度为36℃时，红曲霉高产色素低产桔霉素。而李培睿等[31]的研究也表明35℃有利于红曲霉的生长，且此温度条件下桔霉素产量相对较低。

3.3 溶氧

溶氧与发酵过程中微生物的生长及产物的代谢密切相关，红曲霉液态发酵时，随着通气量的增加或搅拌速度的提高，菌体的生物量和次级代谢产物的产量都有所增加，但是桔霉素的增加比例比色素的大[32-33]。顾玉梅等[11]的研究也证实了高溶氧对色素及桔霉素生成都有促进作用。因此，在产物生成阶段，可尽量降低通气量和搅拌转速，使溶氧保持在一个较低的水平，以增加红曲色素与桔霉素的产量比值。

4 结语

在菌种层面，通过选取优良菌种，菌种改造及混菌发酵的方法可以达到高产色素，低产桔霉素的目的；配制培养基时，以铵盐为氮源，合适的糖为碳源，低pH值，选择性添加某些金属离子可以使色素的产量提高；而用组氨酸等氨基酸为氮源还可降低桔霉素的产量，培养条件为红光，35℃，低溶氧量时，也可实现高产色素低产桔霉素。红曲色素在食品行业应用广泛，色素代谢时产生的桔霉素会威胁人们的健康，降低生产过程中桔霉素的含量，让红曲色素真正具有安全性。

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