外泌体与心血管疾病研究进展

2018-01-17 13:35，，2*

中南医学科学杂志 2018年3期

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(1.中南大学湘雅药学院药理学系，湖南长沙 410078；2.心血管研究湖南省重点实验室)

外泌体(exosomes)是细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)的一种，包含多种蛋白质、脂质及核酸，介导细胞间的物质传递与信号转导，从而调控机体正常或病理状态。人体内多种细胞均可分泌外泌体，外泌体可参与机体血液凝固、炎症、细胞迁移与分化、肿瘤侵袭与转移等过程。外泌体与高血压、动脉粥样硬化、肺动脉高压、心肌梗死、心肌肥大等心血管疾病的发生发展密切相关。因此，外泌体具有广泛的临床应用潜能。本文主要就外泌体在心血管疾病中的作用及机制进行综述，为诊断和治疗心血管疾病提供新思路。

1 外泌体的构成

EVs是一种膜性囊泡，从细菌到植物和人类，均具备分泌EVs的能力。最初认为，EVs是用于清除细胞内的非必需化合物，但现在认为EVs最主要的作用是促进细胞间物质交换。根据囊泡的粒径大小及在体内的形成方式，EVs可分为外泌体、微颗粒(microvesicles)及凋亡小体[1]。外泌体是直径为30-120nm的双层膜性囊泡，广泛存在于血液、尿液、唾液、乳汁、羊膜液、脑脊液、汗液中。外泌体内容物非常丰富，包括蛋白质、脂质及核酸，具有细胞特异性且通常受供体细胞生理病理条件的影响。

常见的外泌体蛋白质包括鸟苷酸三磷酸酶家族的Rab蛋白、膜联蛋白、四分子交联体蛋白、热休克蛋白、膜转运融合蛋白、整合蛋白、细胞特异性蛋白、代谢酶、信号转导因子、核糖体蛋白、粘附分子、细胞骨架蛋白、泛素等。其中，热休克蛋白、膜联蛋白、Rab蛋白可参与细胞内外泌体的装载与细胞间外泌体的转运；四分子交联体蛋白可介导细胞迁移、融合、粘附与信号传导[2]；整合蛋白可促进外泌体与靶细胞粘附；MHC-Ⅱ可促进多泡核内体(multivesicular endosomes，MVEs)和管腔小体的生成[1]。

外泌体中的脂质成分还未被完全阐明，目前发现鞘磷脂、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、单唾液酸四己糖神经节苷脂、磷脂酰肌醇可参与外泌体脂质双分子层的构成，而鞘磷脂、单唾液酸四己糖神经节苷脂还与外泌体脂质双分子层的刚性相关[3]；外泌体中还存在一些脂质成分如胆固醇、神经酰胺、甘油磷脂等[3]。以上脂质成分均有利于维持外泌体脂质双分子层的稳定性。

外泌体中存在多种类型的RNA分子如信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)和环状RNA(circRNA)等。外泌体可携带某些功能性RNA分子作用于靶细胞，而这些RNA分子通常具有细胞或组织特异性，但也有一些RNA分子如miR-206在所有外泌体中普遍存在，这可能是因为其参与了MVEs形成[4]；有研究表明肿瘤细胞分泌微颗粒中包含c-Myc的单链DNA、基因组DNA及cDNA，而外泌体中是否存在DNA分子还有待研究[5]。

2 外泌体的形成与分泌

1980年，科学家首先在网织红细胞向成熟红细胞转变过程中发现了外泌体。细胞膜通过内陷形成早期核内体，早期核内体与高尔基体复合物相互作用形成管腔小体(intraluminal vesicles, ILVs)，特异性内容物经转载进入ILVs并最终形成MVEs。MVEs可在溶酶体内降解，也可在Rab蛋白(Rab11、27、35)作用下，与细胞膜融合并释放到细胞外。

外泌体形成机制可分为转运必需内体分选复合物(endosomal sorting complex required for transport, ESCRT)依赖型和ESCRT非依赖型。在ESCRT依赖型机制中，ESCRT可参与ILVs和MVEs的形成。ESCRT失活会影响外泌体释放效率和内容物组成。但敲除ESCRT后，细胞仍可分泌外泌体，说明外泌体形成也存在ESCRT非依赖型机制。在ESCRT非依赖型机制中，鞘磷脂在Ⅱ型鞘磷脂酶的作用下生产神经酰胺，神经酰胺会促进囊泡膜子域产生；神经酰胺也可以被代谢为鞘氨醇-1磷酸盐，从而活化Gi蛋白耦联鞘氨醇-1磷酸盐受体，此受体是内容物筛选进入ILVs的必需物质；四分子交联体蛋白家族可参与ESCRT非依赖型的胞内分选进程。携带特异性内容物的外泌体通过与细胞膜融合释放到细胞外，再通过直接与靶细胞膜融合或被靶细胞内化，从而将外泌体内容物释放至靶细胞发挥作用。外泌体也可通过“受体-配体”机制影响靶细胞功能[6]。

3 外泌体与心血管疾病

心血管系统是外泌体进行细胞间传递的重要场所，外泌体可作用于邻近或远距离靶细胞并介导细胞间信号传递，该过程依赖于外泌体内容物对靶细胞的作用。

3.1高血压高血压是一种常见多发病，也是心脑血管病的最主要危险因素。但迄今为止，高血压的发病机制尚未完全阐明。近几年的研究表明，外泌体也参与高血压病的发生发展。

用低渗或血管紧张素Ⅱ刺激HEK293T细胞，可上调外泌体中Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体(angiotensinⅡ type Ⅰ receptor, AT1R)的表达；主动脉狭窄大鼠模型血浆外泌体中AT1R表达也上调；将上述两种外泌体作用于AT1R敲除小鼠，可使其系统血压增加30%[7]。高血压大鼠血浆外泌体可上调内皮细胞中细胞粘附分子与纤溶酶原激活物抑制剂-1表达，从而诱导内皮细胞发生炎症反应[8]。高血压条件下巨噬细胞源性的外泌体也可诱导内皮细胞发生炎症反应[8]。糖尿病肾病患者尿液外泌体中上皮钠通道表达升高，被激活的上皮钠通道可进一步导致尿钠增加，从而促进血压升高[9]。在他克莫司诱导的高血压患者尿液外泌体中，Na+-Cl-协同转运体与磷酸化Na+-Cl-协同转运体水平显著升高，两者表达水平与血压升高呈正相关[10]。

3.2动脉粥样硬化动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种慢性炎症反应，是多种遗传基因和环境危险分子相互作用的结果。外泌体可通过参与内皮功能紊乱、血管重构及炎症进程，从而影响AS。

成熟树突细胞源性外泌体膜上的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)可激活NF-κB通路，从而促进内皮细胞炎症与ApoE-/-大鼠AS发生[11]。KLF-5可促进血管平滑肌细胞增殖和迁移，从而介导血管重构并促进AS斑块形成。在KLF-5过表达的人主动脉平滑肌细胞分泌外泌体中，miR-155表达显著上调，富含miR-155的外泌体可由人主动脉平滑肌细胞转移至内皮细胞，从而破坏内皮屏障并增加内皮通透性，从而促进AS进程。此过程与miR-155抑制内皮细胞中VE-cadherin、β-连环蛋白、claudin-1的表达相关[12]。半乳糖凝集素3(galectin-3，Gal-3)通过调控炎症、增殖、凋亡及巨噬细胞趋药性而参与AS进程。氧化应激条件下巨噬细胞可分泌富含Gal-3的外泌体，此外泌体促进单核细胞向巨噬细胞转变；AS患者血清外泌体中也富含Gal-3，此外泌体可促进AS斑块破裂，且外泌体中Gal-3浓度与AS患者的预后呈正相关[13]。

3.3肺动脉高压肺动脉高压(pulmonary hypertension, PH)是肺动脉压力超过一定界值的血流动力学异常状态，可导致右心负荷增大、右心功能不全及肺血管重构。PH的发病机制包括肺动脉内皮细胞(pulmonary artery endothelial cells，PAECs)功能紊乱、肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell SMCs，PASMCs)增殖与凋亡失衡、代谢转变(Warburg效应)、肺血管细胞表型转变及炎症等。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植可抑制肺组织炎症、肺血管重构及右心室衰竭，该过程与MSC源性外泌体相关[14]。在低氧诱导的小鼠PH模型中，MSC源性外泌体可削弱炎症、右心室肥大和肺血管重构进程，从而抑制低氧PH。这可能是因为MSC源性外泌体可抑制低氧条件下信号转导及转录激活因子3的活性，而信号转导及转录激活因子3活化与PAECs、PASMCs的过增殖与凋亡抵抗相关；同时，MSC源性外泌体可下调小鼠血浆中具有促增殖作用的miR-17表达、并上调具有抗增殖作用的miR-204表达[14]。在野百合碱诱导小鼠PH模型中，血浆或肺组织中提取的外泌体可促进健康小鼠表现出右心肥大和血管重构，这可能与外泌体中miR-19b、miR-20a、 miR-20b、miR-145、miR-21表达上调相关；而MSC源性外泌体可逆转野百合碱诱导小鼠PH模型中的右心肥大与血管重构，这可能与MSC源性外泌体中miR-34a、miR-122、 miR-124、miR-127表达上调相关[15]。外泌体作为细胞间的交流媒介，可促进细胞间的信号转导。PASMCs 分泌外泌体中富含miR-143，miR-143可通过外泌体从PASMCs转移至PAECs，并促进PAECs的迁移和血管新生，从而影响PH进程[16]。在脂多糖处理的PAECs中，外泌体释放量增加；用脂多糖处理的PAECs与PASMCs共培养，可诱导PASMCs增殖并抑制凋亡，外泌体释放抑制剂GW4869可消除此现象[17]。

3.4心脏疾病

3.4.1 心肌肥大心肌肥大与细胞内多种信号通路及功能分子的活化相关，其确切的发病机制还未完全阐明。研究表明，外泌体中多种miRNAs与心肌肥大相关。

心肌成纤维细胞源性外泌体可活化MAPK、ERK、p38、Akt信号，从而促进心肌细胞中肾素-血管紧张素系统活化并促进血管紧张素Ⅱ的合成与分泌，并最终诱导心肌肥大[18]。另外，miR-21-3p在心肌成纤维细胞源性外泌体中高表达， miR-21-3p可通过抑制心肌细胞中SORBS2与PDLIM5的表达而促进心肌肥大[19]。在心肌祖细胞源性外泌体中miR-21表达升高，miR-21具有抗凋亡作用。程序性细胞死亡因子4是细胞凋亡的启动因子，同时也是miR-21的靶基因。研究表明，心肌祖细胞源性外泌体可作用于过氧化氢诱导的H9C2细胞中miR-21-程序性细胞死亡因子4通路，发挥抑制凋亡的作用，从而抑制心肌肥大[20]。急性心肌梗死患者血清外泌体中miR-1与miR-133a表达显著上调，两者通过分别靶向调控RasGAP与RhoA影响心肌肥大进程[21]。富含miR-200a的脂肪细胞源性外泌体可活化心肌细胞中mTOP通路，从而诱导心肌肥大[22]。

3.4.2 心肌损伤心肌损伤会诱导心肌细胞死亡并造成脉管系统紊乱。心肌损伤能触发修复机制如心肌纤维化以维持心肌完整性。外泌体可参与心肌损伤进程。

心肌梗死患者血清及尿液外泌体中多种miRNA表达显著上调如miR-208、miR-499、miR-194及miR-34a，其中miR-194、miR-34a与心肌梗死患者并发右心衰显著相关[23]。低氧心肌细胞源性外泌体因富含TNF-α而具有促进心肌细胞凋亡的作用[24]。在糖尿病小鼠心肌细胞中特异性过表达热休克蛋白HSP20，可促进心肌细胞外泌体的分泌并改变其内容物，此外泌体可抑制糖尿病所诱导的心肌损伤与心肌重构[25]。在心肌梗死小鼠模型中，巨噬细胞分泌外泌体中 miR-155表达上调，此外泌体可被转移至成纤维细胞从而抑制成纤维细胞增殖并促进炎症反应，使用miR-155抑制剂可逆转上述效应[26]。

4 外泌体在心血管疾病中的临床应用潜能

4.1干细胞源性外泌体的应用

4.1.1 MSCs源性外泌体 MSCs是一种多能干细胞，可分化为多种细胞类型如心肌细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞等，从而在心血管疾病治疗中发挥重要作用。研究表明，MSCs的培养上清对心脏有保护作用，说明MSCs可通过向靶细胞分泌旁分泌因子发挥生物学作用。近年来，外泌体作为MSCs旁分泌的一种形式广受关注。MSCs源性外泌体具有抗炎、抗血管重构、抗心肌重构、抗凋亡等生物活性。

MSCs源性外泌体富含miR-22，将此外泌体作用于急性心肌梗死大鼠模型可显著缩小心肌梗死面积并抑制心肌纤维化进程，这与miR-22下调甲基CpG结合蛋白相关[27]。另外，MSCs源性外泌体中的miR-221可抑制心肌细胞凋亡，这与miR-221抑制p53相关凋亡调控因子PUMA相关[28]。MSCs源性外泌体可削弱低氧诱导的右心室肥大与肺血管重构。另有研究表明，在盲肠结扎穿刺诱导的败血症小鼠模型中，MSCs源性外泌体具有心肌保护作用且可抑制系统炎症反应。MSCs源性外泌体富含miR-223，抑制MSCs中miR-223表达后，此外泌体不再具有心肌保护作用，也丧失抑制炎症反应的能力[29]。

4.1.2 胚胎干细胞源性外泌体胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)具有分化为机体所有细胞类型的能力。研究表明，ESCs源性外泌体通过促进心肌细胞增殖与血管新生来修复受损心肌，同时还具有抑制凋亡及纤维化等作用。

ESCs源性外泌体可增强心肌细胞活性，进而恢复急性心肌梗死小鼠的心肌功能，这与ESCs源性外泌体中miR-294调控细胞周期、增强细胞活性、促进细胞增殖与分化相关[30]。ESCs源性外泌体也富含血管生成因子如血管内皮生长因子与成纤维细胞生长因子-2，两者可通过促进血管新生来抑制小鼠肢端缺血[31]。ESCs源性外泌体通过抑制炎症因子如ROS、TNF-α的表达、增加内皮血管连接蛋白VE-钙粘蛋白的表达来抑制小鼠神经血管缺血再灌损伤[32]。

4.1.3 心肌祖细胞源性外泌体低氧条件下心肌祖细胞源性外泌体中有11种miRNAs表达上调，这些外泌体具有改善心功能并抑制纤维化的作用[33]。心肌祖细胞源性外泌体富含miRNA-133，miRNA-133可作用于心肌细胞从而抑制其肥大与凋亡[34]。在急性缺血再灌注小鼠模型中，心肌祖细胞源性外泌体可抑制心肌细胞凋亡，可能与外泌体中miRNA-451表达上调有关[35]。在阿霉素诱导的扩张型心肌病小鼠模型中，心肌祖细胞源性外泌体也可显著抑制小鼠心肌凋亡与心肌纤维化，从而改善心功能。

4.1.4 其它来源外泌体一些其它细胞来源的外泌体也可对心血管系统发挥作用。造血干细胞源性外泌体中含有抗凋亡与促血管生成因子的mRNA，这些mRNA可促进内皮细胞增殖并抑制凋亡、增强细胞活性并促进管腔形成[36]。内皮祖细胞源性外泌体富含miR-126与miR-296，两者可促进血管新生抑制凋亡，此外泌体具有抑制缺血再灌注大鼠急性肾损伤作用；人体心包液来源的外泌体中富含许多心血管来源的miRNAs如let-7b-5p、miR-23a-3p等，将此外泌体作用于内皮细胞，可提高内皮细胞血管生成的能力。

4.2临床诊断标记物研究表明，心血管疾病患者血浆或尿液外泌体内容物会发生变化，从而可用于临床诊断，其中以miRNAs与蛋白质的变化最为显著。急性心机梗死诱发心衰患者的血浆外泌体中，p53响应miRNAs如miRNA-192、miRNA-194、miRNA-34a表达显著上调；冠状动脉综合征患者血浆外泌体中，miR-133a表达显著上调[37]；Ⅰ型糖尿病患者血浆外泌体中有7个miRNAs表达具显著性差异，其中miR-16、miR-302d-3p、miR-378e、miR-570-3p、miR-574-5p、miR-579表达下调，miR-25-3p表达下调[38]。高血压合并蛋白尿患者尿液外泌体中有48种蛋白质表达变化，其中21种与高血压显著相关如抗凝血酶Ⅲ、过氧化物酶等[39]。低氧可促进心肌细胞释放外泌体，而此外泌体中TNF-α与热休克蛋白HSP60表达上调。因此我们推测在低氧阶段，急性心肌梗死患者的心肌细胞也会释放富含TNF-α与HSP60的外泌体并进入血液。上述差异性表达的miRNAs或蛋白质均有可能成为临床诊断标记物而用于临床诊断。

5 结语

外泌体是参与细胞间通讯的一种机制，允许细胞间交换蛋白质、脂质和遗传物质，参与了高血压、动脉粥样硬化、肺动脉高压、心肌肥大、心肌梗死等心血管疾病的发生发展，提示外泌体可能成为临床诊疗的新靶点。但外泌体及其内容物在心血管领域的研究才刚刚起步，其准确的靶向调控机制还有待阐明。外泌体内容物庞大而复杂，其在机体内的作用也是多种多样。外泌体疗法通过向靶细胞提供有益的RNAs或蛋白质而促进血管新生与细胞存活、改善机体微环境，并且还具有免疫排斥反应低、便于储存等优点。但外泌体也能够促进癌细胞的生长，如MSCs源性外泌体可通过活化ERK1/2通路来促进胃癌细胞中血管内皮生长因子的表达，从而促进胃癌细胞生长[40]。故外泌体的临床治疗是把双刃剑，如何做到靶向定位、精准调控，是亟待解决的问题。

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