葡萄酒功能性微生物选育研究进展

王雪薇，杜展成，武运*，薛洁*

（1. 新疆农业大学，新疆乌鲁木齐 830052；2. 新疆芳香庄园酒业股份有限公司，新疆和硕 830000；3. 中国食品发酵工业研究院，北京 100015）

随着国内葡萄酒市场的标准化以及人们经济条件的日益增长，消费者对于葡萄酒的质量要求也越来越高，此时，当消费者选择葡萄酒时，其品质尤为重要。然而，目前国内葡萄酒与进口葡萄酒在各方面都存在着差距，其中最明显的就是葡萄酒的口味及风格。进口葡萄酒品种多样，口味独特且风格各异，而中国葡萄酒则风味基本一致，出现产品同质化的现象[1-2]。由于酿酒葡萄的种植期较长，从原料上改变同质化现象耗时且昂贵，而借鉴传统葡萄酒强国的经验[3-4]，采用具有典型的、个性化的酿酒微生物是改善葡萄酒风味快速有效的一种方法。因此，选育具有功能性的葡萄酒优良酿酒微生物对中国葡萄酒产业的发展具有深远的意义。

1 葡萄酒与微生物

人类对于葡萄酒酿造技术的掌握，早于对葡萄酒微生物了解。微生物是葡萄酒酿造的基础，微生物作用于葡萄汁，将葡萄汁转变为葡萄酒。这个过程涉及到很多微生物，一类如酵母菌之类的有益菌，它们将糖转化为酒精，使葡萄酒产生香气，如我们通常说的酿造香，对葡萄酒的口感有重要作用；比如乳酸菌，它们在红葡萄酒和少数白葡萄酒的二次发酵中起到主要作用，可以降低葡萄酒酸度，改善口感，提高稳定性。另一类是葡萄酒酿造有害菌，比如非酿酒酵母，我们一般都认为其为葡萄酒酿造过程中的有害菌，这些杂菌的生长会影响葡萄酒风味，甚至引起葡萄酒品质发生改变[5]。与葡萄酒酿造有关的微生物可以分为：酵母、细菌和霉菌。

1.1 葡萄酒中酵母菌的组成和功能

酵母菌是葡萄酒酿造的灵魂。葡萄酒酿造过程中，酵母将葡萄中的糖转化为酒精和二氧化碳，并在发酵过程中生成醇、酯、醛类代谢产物。这个过程决定了葡萄酒的风味、口感。

目前，有关于葡萄酒的酵母菌有24属120种，几乎包括酵母菌的主要属种[6]。其中主要有酵母属（Saccharomyces）、假丝酵母属（Candida）、德克酵母属（Dekkera）、有孢汉生酵母属（Hanseniaspora）、梅奇酵母属（Metschnikowia）、毕赤酵母属（Pichia）、类裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）、结合酵母属（Zygosaccharomyces）等十个属的酵母[7]。其中酵母属酵母是葡萄酒酿造过程中必不可少的微生物，酵母菌的生长可以抑制葡萄表面霉菌的繁殖，酵母菌在葡萄酒酿造过程中可以将糖转化成酒精、二氧化碳，是葡萄汁转变为葡萄酒的主要微生物；葡萄酒酿造过程中，有400多种挥发性香气物质是酵母的发酵而产生[8]。

在葡萄酒酿造行业中，酵母菌分为酿酒酵母和非酿酒酵母。王凤梅等[9]指出，在酿造过程中虽然非酿酒酵母会产生影响葡萄酒品质的异味物质，但是某些非酿酒酵母却可以增加葡萄酒的香气及风味。

1.2 葡萄酒中细菌的组成和功能

与葡萄酒酿造相关细菌有以下三类：乳酸菌（Lactic acid bacteria）、醋酸菌（Acetic acid bacteria）、芽孢杆菌（Bacillus）。乳酸菌主要有乳杆菌属（Latobacillus）、酒球菌属（Oenococcus）、片球菌属（Pediococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）[10]。在细菌当中酒酒球菌用来进行苹果酸-乳酸发酵（Malolactic fermentation，简称MLF），MLF又被称为二次发酵，是在酒酒球菌的作用下，将苹果酸转化为乳酸的过程，该过程释放二氧化碳。MLF降低葡萄酒酸度，增加葡萄酒的微生物稳定性，影响葡萄酒的感官品质，酸的降低能够增加葡萄酒的顺滑感，大多数乳酸菌能产生葡糖苷酶，葡糖苷酶的足量能够促进葡萄酒品种香的产生[11-12]。

乳酸菌的研究广泛且深入，研究的热点集中于乳酸菌对葡萄酒的影响。对葡萄酒而言大多数细菌都是有害菌，能够对酒的品质造成不同程度的影响，比如醋酸菌会将葡萄酒中的乙醇转化为乙酸，对葡萄酒的品质及风味造成破坏[13-14]。因此在酿造过程中，应尽量避免细菌的感染，并监测葡萄酒酿造过程中整体的微生物状态。

1.3 葡萄酒中霉菌的组成和功能

霉菌是一种丝状真菌，在潮湿的环境中，霉菌会侵染葡萄果实，造成减产，影响其品质。陈酿橡木桶的内外表面、瓶装葡萄酒的软木塞处也容易感染霉菌。大多数的霉菌会影响葡萄酒的外观及口感，并且极易对葡萄酒的风味造成不良影响，部分霉菌的次级代谢产物会对人体造成极大伤害，比如致癌性[15]。然而霉菌也不能一概而论，源自匈牙利的贵腐酒就是由被称为“贵族霉”灰霉菌酿造而成[16]。目前，除了贵腐葡萄酒外霉菌在葡萄酒酿造方面鲜有研究，所以霉菌在葡萄酒酿造行业中还具有很大的研究空间。

2 葡萄酒功能性微生物的研究进展

葡萄酒功能性微生物是生产具有独特风味及口感葡萄酒的最基本和最重要条件，在特色葡萄酒酿造过程中有着不可或缺的地位[17]，没有优质的酿酒微生物就不可能获得优质的葡萄酒[18]。因此，葡萄酒功能性微生物的选择对于建立特色的葡萄酒品牌、树立产业旗帜具有重要意义。

目前，由于葡萄酒市场竞争力和消费者对葡萄酒质量需求的增长，越来越多的学者开始了特色酵母菌的选育与应用，主要方法包括传统菌种筛选、有性杂交育种、诱变育种以及分子生物学技术等[19]。欧洲地区通常使用自然发酵工艺，他们主张当地葡萄酒酵母资源的作用；美国则强调高效生产和打造优质葡萄酒，他们经常使用原生质体融合技术、有性杂交技术，甚至转基因技术来培育酿酒微生物以用于生产；与欧美的葡萄酒大国相比，我国葡萄酒因为产业起步较晚，与之还存在很大的差距[20]。目前，我国采用紫外诱变和原生质体融合技术成功的选育出了一些特色酿酒酵母菌，如耐高温低温、耐受二氧化硫、调节pH等[21]。

2.1 改善葡萄酒品质的微生物

2.1.1 产香酵母

产香酵母在葡萄酒酿造中具有非常重要的作用，有400多种挥发性香气物质是酵母的发酵而产生。目前，在葡萄酒生产当中运用比较广泛的产香酵母一般为产酯酵母，如生香活性干酵母。肖阳等[22]从葡萄酒泥中分离得到一株产香能力强的酵母菌株Pichia sp.，该菌种发酵产香为酯香，其中产生的香气以乙酸乙酯为主。雷静等[23]通过对‘无核白’葡萄自然发酵液分离初筛，筛选出1株可以有效提高葡萄酒的总酯含量的酵母菌株W4，该酵母发酵葡萄酒产酯量可达到7.335 g/L。商敬敏等[24]从葡萄园土壤中分离出了118株酵母菌，其中5株酵母菌发酵的葡萄酒样品中乳酸乙酯含量明显高于其他酒样，果香味优雅浓郁。Perez-coello等[25]从葡萄园种植土壤、果实、叶片中筛选出174株酵母菌，其中13株酵母菌具有良好的产香性状，能够提高葡萄酒中的草药香气。很多研究报道了葡萄酒的发酵香，在葡萄酒发酵过程中产生的葡萄浆果中原本不存在的香气物质，但特定产香酵母的选育极少，我国葡萄酒生产中广泛使用活性干酵母，产品的同质化现象十分严重，筛选特色产香酵母对于我国发展特色葡萄酒具有重要意义。

2.1.2 调节葡萄酒有机酸的微生物

葡萄酒中的有机酸是葡萄酒的主要化学成分之一，有机酸影响着葡萄酒的类型和品质优劣，适量的有机酸可以赋予葡萄酒醇厚、清爽等口感特征要素[26]。葡萄中的有机酸主要包括酒石酸、苹果酸和柠檬酸，其中酒石酸和苹果酸占总酸的90%以上[27]。酸度对于葡萄酒口感具有极大的影响作用，酸度过高会使葡萄酒酸涩感较重，口味粗糙；酸度过低则会使葡萄酒颜色黯淡无光，口感单调。由于地域差异，我国不同葡萄产区其酿酒葡萄之间存在极大差异，东北地区（东北三省）葡萄原料的酸度往往过高，所以在葡萄酒酿造过程中常常面临降酸问题，而西北地区（新疆产区）由于该地区昼夜温差大、降雨量少等气候特点，该葡萄酒产区的酿酒葡萄原料含酸量较低。筛选能调节葡萄酒中有机酸的菌株，从而形成酒厂或特定地区的专属菌株，将改善我国葡萄酒普遍同质化的问题并形成更具区域性特色的葡萄酒。马文瑞等[28]筛选出1株产酸含量高的酿酒酵母Y6，用于小型葡萄酒发酵生产试验中，与市售酿酒酵母71B相比，产酸量提高了1.84 g/L。刘芳[29]选育出1株酿酒特性优良的酒酒球菌SD-2a，以商业菌种作为对照，该菌株对于酒精、低pH值、高浓度SO2具有更为优良的耐受性，MLF速率高，降酸能力强。目前国内外在葡萄酒工业生产中主要使用化学方法调节葡萄酒中有机酸，虽然国内外对于选育能够调节葡萄酒有机酸的微生物研究较多，其在实际生产中的应用尚未报道，将调节有机酸微生物利用于大规模的生产具有良好的前景。

2.1.3 MLF高耐受性微生物

MLF是乳酸菌苹果酸-乳酸酶的作用下，双羧基L-苹果酸转变成单羧基L-乳酸和二氧化碳的过程[30]。MLF过程有利于形成葡萄酒风味的复杂性，对于酿造高品质的葡萄酒非常重要[31]。葡萄酒的MLF过程受各因素的影响，如酒精度、SO2浓度、pH值、温度等。其中酒精含量是影响MLF的主要因素，酒精浓度的增加会抑制MLF；SO2对MLF有明显的抑制作用，SO2浓度与抑制作用呈正相关，不同菌株对SO2的耐受性也有显著差异；葡萄酒中的pH也是影响MLF的重要因素，一般小于3.8；温度对于MLF也有着很大的影响，温度太低会导致葡萄酒无法开始MLF[32-33]。这就要求葡萄酒生产需要高耐受酒精度、SO2浓度、pH值和温度的菌株。因此，选育出MLF高耐受性菌株，已经成为酿造优质葡萄酒的重要因素。段云浩等[33]从自然发酵葡萄酒中分离的14株乳酸菌，并对其酒精度、SO2浓度、pH值的耐受能力进行了测试，筛选出一株MLF高耐受性菌株。Iorizzo等[34]从自发进行MLF的南意大利葡萄酒中，分离、筛选出植物乳杆菌M10，该菌株表现出很好的高酒精浓度和低pH值的耐受力，有很好的MLF发酵表现和β-D-葡萄糖苷酶活性。我国大多数葡萄酒厂依靠进口直投式活性乳酸菌或自然发酵的方法。对葡萄酒进行MLF，致使生产成本增加或葡萄酒质量很难保证，筛选MLF高耐受性微生物，并将其广泛用于我国葡萄酒的生产，对于确保葡萄酒MLF过程，保证葡萄酒品质，具有重要的意义。

2.2 葡萄酒中降解有害物质的微生物

2.2.1 低产氨基甲酸乙酯微生物

酵母代谢过程中精氨酸产生的尿素是葡萄酒酒精发酵中重要的氨基甲酸乙酯（EC）前体物质。研究表明酿酒酵母具有以应变特异性代谢精氨酸和尿素分泌的能力。不同酵母菌对降解精氨酸产生尿素的能力不同，在MLF中，乳酸菌代谢对EC的产生有着显著影响[33]。因此，选育不分泌或分泌尿素量低的酵母菌株，是降低葡萄酒中EC含量的主要措施之一。付方圆[35]筛选出的酵母菌Y44及植物乳杆菌LB均比商业酵母产生更低的EC。国外对于能够降解尿素的微生物，通常采用基因改造的方法，Coulon等[36]根据氮代谢抑制原理及调节机制，利用基因工程技术构建出EC基因工程菌，Suizu等[37]通过破坏CAR1基因构建不产尿素的酵母菌。总之，对酵母基因进行改造降解葡萄酒中尿素，对降低酒中EC含量有重大意义，但这些研究仍在小型实验室阶段，未用于大型生产当中。

2.2.2 降解生物胺微生物

葡萄酒中的生物胺来源广泛，从葡萄原料开始，葡萄酒酿造整个过程微生物代谢都可产生。葡萄浆果本身就含有组胺、酪胺、腐胺等多种生物胺，一些生物胺含量在发酵过程中降低，可能是因为微生物的降解作用[38]。研究表明，MLF过程之后生物胺含量显著增加[39-40]。葡萄酒中的生物胺主要来自乳酸菌引发的苹乳发酵，乳酸菌可能是导致生物胺增加的原因，因此，选育降解或低产生物胺的乳酸菌是降低葡萄酒中生物胺的有效措施。李华等[41]对我国自主筛选的22株优良酒酒球菌进行了检测，均不产生腐胺、酪胺、组胺，具有较高的生物胺代谢安全性。王德良等[42]从酿酒葡萄表面筛选得到一株能够有效降低添加腐胺、组胺和酪胺的植物乳杆菌，该菌株能直接应用于葡萄酒的酿造，具有较好MLF高耐受性，苹果酸-乳酸转化率极高，可有效的降低葡萄酒中的生物胺的含量。目前国内外对于筛选产生生物胺微生物研究广泛且深入，但选育能直接降解葡萄酒中生物胺微生物的研究很少。选育降解葡萄酒中生物胺的微生物，逐渐成为相关微生物研究的热点问题之一。

2.2.3 降解赭曲霉毒素A微生物

赭曲霉毒素A（OTA）是曲霉属和青霉属产生的次级代谢产物，它对肾脏和肝脏造成损害，还能致癌、致畸形、致突变，对免疫系统造成损害。食品法典委员会（CAC）认为葡萄及葡萄酒中的OTA污染是最严重的健康风险之一，仅次于谷类。运用生物方法清除OTA引起了相关领域广泛的关注，许多研究者们开展了相关的研究。生物法去除OTA有两种主要形式：一种是使用能够降解某些产毒微生物的生物酶，从而达到去除毒素的目的；另一种是利用一些微生物吸附OTA以从食品中去除。有研究表明，酒酒球菌和植物乳酸杆菌等细菌以及酵母细胞壁制剂等都可有效降低葡萄酒中的OTA含量[43]。Abrunhosa等[44]选择76株真菌进行OTA降解能力的评估，其中以曲霉为主的51株菌株能够降解80%以上的OTA，其中黑曲霉、棒曲霉、赭曲霉、杂色曲霉和温特曲霉降解能力达95%以上，且黑曲霉和赭曲霉降解OTA得到的化合物不同。目前，利用生物技术从葡萄酒中去除OTA的研究主要集中在微生物吸附以去除葡萄酒中的OTA，关于直接降解葡萄酒中OTA的技术应用报道很少。利用微生物降解葡萄酒中的OTA，并将其规模化生产应用需要更深入的探索和研究。

3 展望

随着进口葡萄酒对国产酒冲击的增大，国内葡萄酒市场竞争日益激烈，人们对葡萄酒品质需求的提高，葡萄酒的品质就显得尤为重要。采用酿酒微生物对葡萄酒的风味进行改善确是一种快速且有效的方法，单一品质的酿酒微生物已经不能够满足葡萄酒行业的需求。因此，为了适应不同区域、不同品种、不同风格、不同消费需求的葡萄酒的生产，选育典型性强、个性化突出的功能性酿酒微生物势在必行。因此，选育具有功能性的葡萄酒优良酿酒微生物对我国葡萄酒产业的发展具有十分深刻的意义。