HIV-1表型耐药检测方法研究进展

李育芬 廖斌 冯瑞琳 刘芳芳

（昆明市疾病预防控制中心 云南 昆明 650228）

采用HIV耐药检测了解患者的HIV耐药性，对治疗艾滋病患者和控制疫情十分重要。常用检测方法有基因型和表型耐药检测，基因型耐药检测是间接法，针对已被证实的突变位点，不能发现潜在的耐药突变点，不能解释多种耐药突变位点的协同吉抗效应。表型耐药检测可克服其不足，准确检测HIV病毒的耐药性。本文对HIV-1表型耐药检测方法学进展作一综述。

1.HIV-1表型耐药检测原理

美国食品和药品管理局批准用于HIV抗病毒治疗药物分三类：蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂和融合抑制剂。HIV表型耐药检测就是针对这些药物而进行。

表型耐药检测是病毒耐药性分析的标准方法，运用体外药敏分析法，在逐渐增加药物浓度下对HIV复制能力直接评价。结果以50%抑制浓度（IC50）来表达，并与同类野生株的IC50或临界值（CUT-OFF值）相比，通过其倍数改变评价耐药程度[1]。

2.常用的HIV-1表型耐药检测方法

2.1 传统表型耐药检测方法（即标准表型检测）

其实质是体外药敏试验，从病人体内分离外周血单核淋巴细胞（PBMC），与植物血凝素（PHA）刺激正常人的PBMC共培养，分离出病毒株并计算其50%组织培养感染计量（TCID50），用一定的病毒量（1000 TCID50）体外感染PHA活化的正常人PBMC，在梯度稀释的药物浓度下孵育病毒，7天后用ELISA法检测上清液中P24抗原量，以此计算IC50，与野生株IC50或cut-off值进行比较得出病毒株的耐药程度[2]。该法检测的病毒是通过分离培养患者PBMC获得，不是直接来自患者血浆的病毒。但前者中的HIV-1耐药突变迟于后者。

2.2 C8166-R5细胞替代PHA活化PBMC的表型耐药检测Krowick H等人通过对10种细胞系表达CD4受体、CCR5、CXCR4辅助受体的能力、HIV感染力及耐药检测分析等方面的研究，认为C8166-R5细胞具备替代PHA活化PBMC用于表型耐药检测的效果，有很好的治疗效果预此种培养增殖周期短（倍增时间＜16h），易于长时间稳定培养[3]。

2.3 用改造的细胞进行表型耐药检测

2.3.1 早期构建的HeLa/CD4+细胞表型耐药检测 在1988年，Chsebro等构建了HeLa/CD4+细胞用来定量检测HIV-1，随后进行表型耐药检测。该法简单但缺少CCR5辅助受体，仅适用于T嗜性CXCR4 HIV-1的检测[4]。

2.3.2 对两种辅助受体的HIV-1进行表型耐药检测 AStuko Hachiya等将用来做空斑减数实验的Hela∕CD4+进行改造筛选产生了MACIC-5细胞，其稳定表达CD4+、CXCR、CCR5并包含整合的β-半乳糖苷基因，通过蓝斑形成单位（BFU）的降低反映药物的抑制活性，根据BFU降低的百分数与药物浓度可计算出药物对病毒的IC50[6]。该法快速简单，只需血浆标本病毒载量＞10000拷贝/mL2周可得到结果（传统方法需一个月左右）。

2.3.3 “All-in-one Assay”的表型检测方法 Atsuko Hachiya在建立了基于MAGICS细胞检测法后，2003年发展了“All-in-one Assay”表型检测方法。该法能检测病毒在体内药物浓度下的药物敏感性结果。使针对每个个体特异的表型检测成为可能。

2.4 使用重组病毒HIV表型耐药检测方法

此类方法目前应用最广泛。其原理是将反转录-PCR扩增的患者体内基因插入载体中，通过重组病毒进行表型耐药检测。即把逆转录—PCR扩增的患者HIV-1蛋白酶（PR）和逆转录酶（RT）区基因插入载体中，通过产生的重组病毒进行表型耐药检测。其耐药表型是测定药物对病毒的50%抑制浓度（IC50），分析与野毒株之间IC50相差倍数，5～10倍以上为耐药阳性。

2.4.1 同时针对HIV蛋白酶、逆转录酶、整合酶抑制剂的定量表型耐药检测方法。Jan weber等人设计的该方法将患者来源的HIVp2-INT(gag-p2/NCp7/pl/p6/pol-PR/RT/IN)基因序列以一个片段（3428bp）或两个重叠片段（I657bp和2002bp）的形式PCR扩增，然后将PCR产物整合到pRECnfl-TRR-P2-INT/URA3载体上。该载体几乎包含整个HIV-1基因组，只是用酵母菌的尿嘧啶合成基因（URA3）代替3428bp的p2-INT片段。可评估新抗病毒药物及多种治疗方法失败的患者的耐药。

2.4.2 改造的重组病毒表型测定法 美国Virologic公司Petropoulos等人， 1999年对重组病毒表型测定法进行改造。利用耐药检测载体（RTVs）来测定样本对PR和RT抑制剂的敏感性，该载体包含一个荧光素激发报告基因和从病人血浆中提取扩增的HIV-1PR和RT序列。通过将RTVs与一表达细胞内小鼠白血病病毒4070A的env的表达载体共转染人胚肾293细胞，然后在不同药物作用下培养重组病毒，通过检测报告基因来判断重组病毒的复制能力。该法高通量且8～10天完成。可用于治疗失败者新治疗药物的选择及感染耐药毒株者初治方案的拟定。

2.4.3 单细胞水平表型测定法 治疗过程中 HIV在病人体内发展为耐药毒株，继续原治疗方案用药原因有：耐药毒株对药物组合还有部分敏感性，对一种药物敏感性降低并不干扰其他药物的抗病毒活性；其次耐药突变的病毒比敏感的野生毒株的复制适应性要差很多。Zhang等2004年建立了一种新的单细胞水平表型测定法，可对残余药物敏感性和复制能力降低的耐药毒株进行药物敏感性测定。可对临床治疗失败的用药方案提供依据。

2.5 用快速生化反应检测药物敏感性的表型检测法

Ganla-Lema和Heneine建立了非细胞依赖型耐药检测法，利用生化法进行逆转录酶活性的检测进行HIV-1表型耐药分析。该法无需分离培养病毒1～2天内得到结果且对实验室要求低，提高检测可重复性并降低成本。

2.6 虚拟表型耐药检测

“虚拟”表型由美国强生Virco BVBA公司研发，把基因突变框架与已知的数据库中成对基因型和表型进行比对得到预测表型结果。该技术依托于已有的HIV蛋白酶逆转录酶基因序列以及相应表型结果，根据患者HIVDNA或RNA序列的耐药突变，对耐药程度的表现进行预测。此技术与表型检测相比耗时少（1～2周），价格低，结果直观。

3.表型耐药检测的优势

HIV表型耐药检测在逐步增加的药物浓度下，体外直接观察病毒的生长情况。

3.1 直接检测病毒对药物的敏感性

基因型检测法建立在已知的耐药突变位点与药物耐受关系的基础上，对于这些区域外及这些区域内的非典型突变。基因型耐药检测系统内未提及，可能遗漏，影响最终结果[7]。表型检测方法却能检测出。

3.2 基因型检测结果须用解释系统才能预测病毒的耐药性有时不能正确解释多个突变位点之间的协同，吉抗效应；而HIV表型耐药检测所有突变的净作用，结果易于解释。

3.3 表型耐药检测方法不受病毒亚型影响

基因突变位点推测耐药性的解释系统主要针对B亚型[5]。

3.4 可对HIV-1耐药情况进行定量测量。可评估任何抗病毒药物。

4.HIV-1表型耐药检测的局限性

大多数HIV表型耐药检测方法需培养病毒，有局限性。

4.1 需生物安全三级实验室 易受环境因素，细胞、病毒状态，操作人员的人为因素等影响，重复性较差费用高。

4.2 耐药性检测周期长 虽然重组病毒检测在简化了步骤，但未明显地降低检测周期。

4.3 未对所有药物制定cut-off值，未确定表型检测之间的标准。

4.4 检测病毒对单个抗病毒药物的敏感性，不反映多个抗病毒药物之间的吉抗和协同作用。

4.5 通常不能检测出突变的病毒株比例较低耐药株。病毒载量＜1000copies/mL时，不易得到检测结果。

5.HIV-1表型耐药检测的未来发展

HIV-1表型和基因型耐药性检测各有优势，互为补充。基因型耐药检测更简单适用。但产生多种突变位点和复杂的交互作用，多种治疗方案都无法得到理想治疗效果，或评估病毒对新药物的敏感性时，需快速、简单、有效的表型耐药检测方法。目前尚未有标准化的HIV-1耐药表型检测系统，未来会向着更易于操着，耗时短，结果稳定可靠的方向发展。

[1]王陇德.中国艾滋病的流行与控制[M].北京卫生出版社:541-549.

[2]邵一鸣.HIV耐药监测策略和检测技术[M].人民卫生出版社:1-210.

[3]王佑春.艾滋病实验室检测技术与质量保证[M].科学出版社:197-216.

[4]吴守丽，HIV耐药性耐药检测研究进展[J].中国病毒学杂志，2012，2.

[5]贾豫晨，HIV-1耐药性研究进展[J].云南医药，2013，34

[6]乔录新，艾滋病毒1型表型耐药检测研究进展[J]国际流行病学传染病学杂志，2012.

[7]左中宝，抗病毒治疗患者HIV耐药发生的研究[J].传染病信息，2015，28.