磷脂酶D1信号对神经干细胞向神经分化的重要影响

张金梅 杨远荣

作者单位：434020 华中科技大学同济医学院附属荆州医院药学部

神经干细胞（neural stem cells，NSCs）是一种能自我更新和增殖的多能干细胞，可分化为各种类型的神经细胞，即神经元[1]。1992年，NSCs最先从纹状体组织和小鼠脑组织中分离出来。随后人们对NSCs在中枢神经系统中的分布、发育及寿命、特性和潜能的认识取得了重大进展[2]。NSCs可从原代培养的皮层或在有丝分裂生长因子如表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子存在的条件下从传代培养的海马中分离得到。有丝分裂生长因子对NSCs的增殖很重要，并能维持其未分化状态。多种信号的协同作用使胚胎NSCs在成熟大脑中形成许多各种各样的神经元和神经胶质细胞[2]。特异性转录因子在NSCs分化为神经元时起重要作用。除了向嗅球提供神经元外，NSCs对海马的可塑性也很重要[3]。此外，在动物模型和人体试验中，由于NSCs的激活或被移植到中枢神经系统损伤区可导致再生，因此其临床应用受到了广泛关注。

一、磷脂酶D （phospholipase D，PLD）的结构

PLD是一种广泛存在的酶，水解磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC），产生磷脂酸和游离胆碱。在乙醇和1-丁醇等伯醇存在时，PLD优先催化转磷脂酰化反应，而不是水解反应，后者产生磷脂酰醇，而不是磷脂酸（phosphatidic acid，PA）[4]。PLD两个主要的同工酶PLD1和PLD2在哺乳动物细胞中已被鉴定[5]。PLD1是一种表观分子量为120 kDa、含有1 074个氨基酸的蛋白，含有2个HKD模体（HxKxxxxD序列、组氨酸“H”、任意氨基酸“x”、赖氨酸“K”和天冬氨酸“D”），这在体外和体内都是酶促催化反应的关键。PLD同工酶的其它高度保守结构域还包括phox（PX）、结构域PH和PI4、5P2结合域。5P2结合域是小GTPase ARF激活PLD1所必需的[4]。PX结构域调节蛋白与蛋白之间的相互作用，或者优先与PI3,4,5P3结合[6]。PLD1还有一个保守的环状结构域，这个环状结构域参与PLD1的自动抑制，删除它后PLD1的基础活性升高。

二、PLD1的功能

研究证明，PLD1参与炎症、肿瘤细胞的侵袭和转移、脂质代谢及神经发育等多种细胞机制[7-9]。PLD1已成为许多疾病如传染病、癌症、心血管疾病和神经退行性疾病的药物作用靶点[8,10]。PLD1分布在整个细胞中，特别是在细胞核周围、高尔基复合体和未受刺激细胞的早期内涵体中。受到刺激后PLD1会重新分布到质膜上。PLD1表达的增加、它的亚细胞定位和催化活性的改变对神经元的增殖、分化、囊泡运输和细胞骨架的重排具有重要作用[11-12]。PLD1在功能各异的脑区表达，包括大脑皮层、海马、脑干、脊髓和嗅球。最近的研究表明，PLD1的信号依赖性激活对NSCs的神经元分化具有重要意义[13-14]。

三、PLD1促进NSCs形成神经元的作用机制

（一）转录激活因子3（activators of transcription 3，STAT3）信号通路

研究已证实，STAT3能促进体外培养的NSCs形成神经元[14-15]。STAT3是一种重要的转录因子，调节胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表达。而且，STAT3与DNA的结合受ser727或（和） Tyr 705位点磷酸化的影响。STAT3与CBP/ p300和STAT/ p300/ Smad复合物的不同结构域结合，作用于星形胶质细胞特异性GFAP启动子中的STAT结合元件，在诱导NSCs星形胶质细胞分化方面尤其有效。含Sh2结构域的酪氨酸磷酸酶-1（shp-1）通过STAT3（Tyr705）的直接去磷酸化而对STAT3信号进行负调控。重要的是，这种依赖于shp-1的STAT3抑制机制与NSCs中PLD1指导的神经细胞形成密切相关。PLD衍生的PA与shp-1相互作用并抑制其活性。外源性地添加PA可诱导NSCs中shp-1磷酸化和STAT3（Tyr 705）的去磷酸化。而且PLD1基因敲除可抑制shp-1的活性，影响STAT3（Tyr 705）的去磷酸化。因此，PLD1通过控制NSCs中shp-1/ STAT3的激活而促进神经元形成，抑制神经胶质细胞。

（二）抗凋亡蛋白Bcl-2信号途径

抗凋亡蛋白Bcl-2是细胞凋亡信号通路中重要的调控因子，抑制细胞死亡[16]。Bcl-2家族蛋白影响神经细胞的分化和凋亡，在Bcl-2缺陷的胚胎中，神经元突起延伸的能力下降[17]。在小鼠胚胎干细胞中，Bcl-2对神经元的谱系分化至关重要[18]。而且，修饰抗凋亡基因可促进神经前体细胞和NSCs的神经元分化[19]。

研究表明，Bcl-2与PLD1介导的神经元分化有关。PLD1在多种细胞中调控Bcl-2的表达[20-21]。例如，PLD1通过c-Jun氨基末端激酶/ STAT3信号通路调节Bcl-2的表达，从而导致H19-7细胞的神经元分化[17]。另有研究报告，PLD1可增加Bcl- 2的表达量并促进NSCs中Bcl-2介导的信号传递[13]。这些结果表明PLD1通过调控Bcl-2的表达而影响NSCs的神经分化。

四、PLD1在NSCs向神经分化中的作用

神经生长因子诱导PLD1表达，调节神经细胞向神经元分化[22]。PLD1也参与碱性成纤维细胞生长因子诱导H19-7细胞的突起生长[17]。PLD1还可纠正家族性阿兹海默症患者变异神经元中受损神经突起的生长能力[23]。Yoon等[24]首次报道PLD1是NSCs向神经元分化中突起生长所必需的调节分子。

（一）PLD1在神经命运决定中的作用

在大脑发育过程中，每个神经元都发育成一个轴突和多个神经突起，最终形成突触[25-26]。为了确保神经元的精确连接，神经元是由多个步骤发育而成，其中包括轴突的生长及分支、引导和突触形成[26]。细胞骨架重排是神经形态形成的动力学支持。在Rho家族蛋白的GTPase中，其成员RhoA、Cdc42和Rac1是典型的细胞骨架重排的重要调节因子。Rho家族GTPase作为一个分子开关，从不活跃的5'-二磷酸鸟苷结合状态转换为活跃的5'-三磷酸鸟苷结合状态。一旦被激活，它们就可以与特定的效应分子相互作用。RhoA、Rac1和Cdc42在树突发育中起核心作用。在发育的大脑皮层中，与Rho相关的GTPase的差异激活有助于形态多样性的产生。Rac1和Cdc42促进神经突起的形成和生长。相反，RhoA的激活抑制神经突起的形成并引起神经细胞收缩。因此，Rho家族GTPase的调控对于指导下游生物反应如轴突生长以及神经元发育过程中的突触成熟至关重要。

Rho家族GTPase是PLD活性的重要调节者，尤其是PLD1的活性是与Rho家族的GTPase相互作用来调节[27]。转染RhoA、Cdc42或者Rac1能激活PLD1[28]，PLD1与肌动蛋白细胞骨架的调控有关[27]。通过这一机制，PLD1能调控许多生理功能如细胞迁移和神经元轴突的形成。在NSCs的神经元分化期间，Cdc42和RhoA的表达水平上升，PLD1和Cdc42位于神经突起中，而RhoA位于细胞质基质中[28]。Cdc42与PLD1结合，形成无活性的Cdc42N17，PLD1活性受阻，神经突起生长。

（二）PLD1在神经分化、成熟中的作用

神经系统的形成和发育经过一系列组织有序的NSCs增殖过程，其迁移距离相当远，最终分化成数十亿的神经元和神经胶质细胞，构成大脑[29]。在此过程中，Ca2+信号对大脑的发育非常重要[30]。Ca2+水平的上升可调节PKCα的活性和从基质到细胞膜的易位[31]。在多个细胞系和原代细胞中，PKCα调节Ca2+依赖性分化，提高细胞内Ca2+水平后可在突触可塑性中发挥重要作[13,32]。PLD催化PC水解成PA和胆碱。PA本身作为细胞内信使或由PA磷酸水解酶进一步转化为二酰基甘油，这对C激酶的激活十分重要[33]。PLD1的激活和磷酸化是由C激酶调节的，PLD和C激酶亚型在多种细胞类型中也有这种类似的关系[13]。近年来研究发现，细胞内Ca2+浓度的增加影响NSCs中PKCα的激活和轴突生长[13-14]。此外，PKCα特异性抑制剂在NSCs的分化中可降低PLD1的活性,影响PLD1信号强度[13-14]。再者，细胞内Ca2+通过与海马钙蛋白（hippocalcin，HPCA）形成复合物，使PKCα转位到细胞膜上，从而促进神经细胞形成。于是，NSCs中PKCα通过与磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1直接结合而被激活。PKCα的上游信号PLD1引起神经突起生长[14]。

另一个重要的Ca2+信号因子-磷脂酶C（PLCγ），在多种细胞中也影响PLD1信号[13,17]。当用某些生长因子处理时，PLCγ被磷酸化并产生二酰基甘油和 1，4，5-三磷酸肌醇（IP3），从而激活PKCα，增加胞内Ca2+[34]。研究表明，PLCγ信号通路可提高细胞内Ca2+浓度，调节新皮层神经元祖细胞迁移和神经分化[13,35]。此外，在NSCs向神经元的分化期间采用特异性抑制剂抑制PLCγ，可减少PKCα的磷酸化和激活[13]。以上结果表明，PLD1参与了细胞内Ca2+信号分子包括PLCγ、PKCα对NSCs的神经分化调节作用。

HPCA是一种高亲和力的钙结合蛋白，这仅限于在中枢神经系统和海马CA1区锥体细胞最丰富的部位。在大脑发育过程中，HPCA的表达急剧增加，同时伴随突触的形成。HPCA属于神经元Ca2+传感器蛋白家族，该蛋白具有一个CA2+/肉豆蔻酰基开关，可使其在细胞内的Ca2+浓度增加时易位到细胞膜上[14]。HPCA也受Ca2+介导的PLD1信号通路的调控[14]。在NSCs的神经分化中神经生长因子如NT-3、NT-45和BDNF的表达依赖于Ca2+的结合和HPCA的肉豆蔻酰化[14]。HPCA直接与PKCα结合可促进PKCα调节的激酶级联反应；PKCα依赖的PLD1的激活是神经突起生长所必需的。并且，PLD1和HPCA甚至在胚胎14 d时在大鼠大脑皮层同时出现，HPCA依赖的PLD1激活是NSCs向神经元分化的必要条件。它们的协同作用对NSCs的神经形成有深刻的影响[14]。

PLD1在细胞生长、存活、分化、膜转运和细胞骨架组织等多种功能的调控中发挥重要作用。近年来研究发现，PLD1在NSCs向神经的分化中也起关键调控作用。PLD1参与多种信号通路包括Rho家族GTP酶和Ca2+信号等的调节，影响轴突生长、突触发育及其可塑性。因此，PLD1是NSCs向神经元分化的重要调节者。研究PLD1对NSCs向神经分化中的调控作用，对深入研究NSCs的分化和神经元的再生有重要的指导意义，并有望用于修复受损的神经元，因此具有一定的临床价值。