骨髓间充质干细胞成肌分化在骨骼肌再生中的应用

李鹏 郭修田

作者单位：200071 上海中医药大学附属市中医医院肛肠科

骨骼肌是人体最丰富的组织，约占人体体重的40﹪。它的损伤会导致肌肉和功能的丧失，而手术治疗并不能完全恢复损伤的骨骼肌，尤其在大量肌肉丢失的患者[1]。损伤部位周围的卫星细胞作为肌源性干细胞，在骨骼肌损伤后能够迅速的活化，增殖，迁移至损伤区域，产生成肌细胞并形成新生的多核纤维或与损伤的肌纤维融合，从而促进骨骼肌再生。但是，卫星细胞在通过肌组织和内皮细胞层时受到限制，并且在肌肉注射卫星细胞1 d 后仅有不足1﹪的成肌细胞存活[2-3]。此外，研究发现卫星细胞在体外很难纯化扩增，体内移植不仅移植率低，还会很快衰老死亡[4]。不仅如此，早期组织学研究发现卫星细胞的比例从出生后的35﹪～40﹪下降到成年时的1﹪～ 4﹪[5]。近年来，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）因其四大特性而广泛用于组织工程学研究，包括：多向分化潜能，旁分泌潜能，免疫调节与抑制功能，便捷的分离和扩增[6-8]。本篇综述旨在介绍BMSC的成肌分化潜能在骨骼肌修复与再生中的应用。

一、BMSC的特性

BMSC作为成体干细胞，不仅拥有自我复制的潜能，还可分化为其他多种细胞系，如脂肪细胞，软骨细胞，肌细胞，神经元以及内皮细胞等[9-11]。国际细胞治疗协会提出定义间充质干细胞的最低标准：首先必须拥有贴壁特性与成纤维细胞样形态；其次必须表达CD105，CD73和CD90，并且缺乏CD45，CD34，CD14或CD11b，CD79α 或 CD19和HLA- DR表面分子的表达；最后可分化为成骨细胞，软骨细胞和脂肪细胞等[12]。近年来，BMSC在再生医学领域受到重视，BMSC的分化潜能和旁分泌特性使其成为组织修复的关键选择，通过分泌可溶性因子和释放外泌体以促进组织的修复与再生[13-15]。Nakamura等[16]采用BMSC来源的外泌体治疗由心脏毒素损伤的大鼠胫骨前肌，发现外泌体可显著促进成肌分化与血管再生，虽然成纤维细胞生长因子2、粒细胞集落刺激因子、血小板衍生因子等肌肉修复相关因子水平较低，但却有大量的与肌肉修复相关的miRNA产生，深入研究发现BMSC来源的外泌体促进成肌分化和血管再生的作用一部分是由miR-494介导的。许多研究证实BMSC拥有免疫调节的潜能，它可通过与先天和适应性免疫细胞相互作用，也可通过细胞间的直接接触和分泌可溶性因子发挥免疫调节功能[6,17-18]。BMSC的多种潜能使其能够在组织器官等修复与再生方面发挥重要作用。

二、BMSC在成肌分化的角色

在1998年，Ferrari等[19]最初采用BMSC治疗损伤的肌肉，发现它会迁移至损伤部位，并产生成肌分化从而促进损伤肌纤维的再生。在此之后，许多学者都致力于BMSC对于损伤肌肉的修复与再生方面的研究。

BMSC的免疫调节能力使其能够有效的改善肌肉损伤的局部炎症反应。Helal等[20]将1.5×106个BMSC注射在大鼠短收肌损伤处，28 d后与对照组相比，发现BMSC组可显著降低促炎因子的表达，如：白介素6（interleukin,IL- 6），白介素 1β，肿瘤坏死因子 α，转化生长因子 β1，干扰素α，并能上调IL-10的水平，认为局部注射BMSC可通过抑制炎症细胞因子的释放与抗炎细胞因子的活化改善损伤处的免疫反应与促进骨骼肌的再生。BMSC还可通过降低TGF-β1的水平以抑制由骨骼肌损伤导致的纤维化。然而，Gala等[21]将BMSC移植在肌肉后却发现损伤部位的促炎细胞因子 IL-1β，IL-1α，IL-6 升高，尤其是 IL-1β，并伴随白细胞和巨噬细胞的浸润，提示BMSC移植在骨骼肌后会产生局部急性炎症。

Anabel等[22]将LacZ标记的BMSC注射在免疫缺陷小鼠的由心脏毒素损伤的胫骨前肌后，发现β半乳糖苷酶阳性细胞从注射区域迁移至胫骨前肌损伤处，并且混合肌纤维的数量显著增加，提示BMSC移植有助于改善心脏毒素损伤的胫骨前肌的再生和重塑。而Winkler等[23-24]则采用不同数量的BMSC治疗比目鱼肌开放性损伤，发现107个细胞对于肌肉收缩力的恢复达到最好的效果，并且移植BMSC的数量与肌收缩力的恢复呈对数关系，提示BMSC可促进骨骼肌功能的恢复。此外，他又通过对比损伤后立即移植BMSC与损伤后一周的延迟移植对于受损的比目鱼肌肌力的恢复疗效，发现两种移植方式对于肌收缩力的恢复并没有显著差异。

Von等[25]通过研究BMSC移植对骨骼肌损伤的恢复与性别的关系，移植相同数量的BMSC至损伤的比目鱼肌，发现BMSC可显著促进骨骼肌力量的恢复，而且雄性与雌性鼠并无差别。在此之后，他[26]同样采用比目鱼肌损伤模型，移植2.5×106个BMSC到损伤部位，结果发现与对照组相比，治疗组肌收缩力显著增高，但组织学分析显示两组并没有显著差异，提示自体BMSC移植引起的收缩力的改善也许是通过损伤处的慢肌纤维向快肌纤维转换的方式引起的。

三、生物材料的应用

虽然BMSC移植可促进损伤肌肉的再生，但它在损伤处的生存率及数量却较低，这大大缩减了移植干细胞的治疗效果。在移植前，对干细胞进行预处理能够显著改善干细胞的特性及生存率。细胞外基质在骨骼肌的再生和恢复中尤为重要，它可为BMSC提供一种适宜的生存环境，并能够产生多种细胞因子从而促进BMSC的增殖和分化[27]。Merritt等[28]将肌肉来源的细胞外基质移植在面积为1 cm2×1 cm2腓肠肌全层损伤处，7 d 后再将BMSC移植在相应细胞外基质上，与对照组相比，实验组显示更多的血管和肌纤维的生成，以及更短的恢复时间。

随着科技的发展，越来越多的生物材料用于组织工程学研究以达到促进组织再生的目的。这些生物材料与细胞外基质作用相同，都具有生物相容性，不仅可作为干细胞移植载体，还能为干细胞营造一种三维的类似体内的细胞微环境，甚至一些还可诱导干细胞向骨骼肌定向分化。Kheradmandi等[29]将BMSC移植在壳聚糖聚乙烯醇纳米纤维载体上，再将其移植在兔子下肢肌肉损伤处，发现能够促进细胞增殖，并能降低免疫反应。Zhao等[30]将没有成肌细胞因子诱导的BMSC移植在一种复合材料上——聚乙烯乙二醇多壁纳米薄膜，发现成肌细胞标志物如成肌细胞分化蛋白 1（myogenic differentiation1，MyoD1），结蛋白，肌球蛋白重链2（myosin heavy chain2，MHC-2）以及骨骼肌特异性标志物（肌钙蛋白C，兰尼碱受体）高表达，但并没有出现脂肪，软骨，成骨等标志物，提示此种纳米薄膜可定向促进BMSC向成肌细胞分化，从而促进骨骼肌修复。

近来，水凝胶被广泛用于干细胞，许多研究证明它能促进干细胞的增殖、分泌、分化。Xu等[31]将BMSC压缩在弹性膨胀系数为20 Kpa的温敏性水凝胶中，发现可显著促进BMSC成肌分化，并表达最高的成肌细胞标志物，如MHC，肌生成素，MyoD1，MHC-2，证实温敏性水凝胶能够促进干细胞的成肌分化与骨骼肌再生。在一个大鼠压力性尿失禁模型中，Du等[32]采用BMSC联合藻酸钙凝胶治疗，与对照组相比，BMSC组不仅有更多的结蛋白，平滑肌肌动蛋白α产生，而且漏尿压显著增高，证实BMSC在压力性尿失禁的微环境中可分化为肌细胞。

Egusa等[33]将培养BMSC的成肌分化培养基放置在一种可产生周期性张力的装置，RT-PCR发现骨骼肌成肌标志物基因显著上调，包括成肌调节因子5，肌生成素，成肌调节因子4，但没有平滑肌标志物基因，如心肌蛋白，平滑肌激动蛋白α，并在治疗5 d后产生肌球蛋白和肌生成素阳性的肌管，提示采用这种装置可定向促进BMSC成肌分化。Haghighipour等[34]将BMSC培养在Ⅰ型胶原纤维包被的硅胶膜上，并将其置于10﹪，1 Hz的循环单轴应变力装置添加胰岛素样生长因子1，发现同时采用装置和胰岛素样生长因子1可显著促进肌细胞生成素和成肌调节因子6的表达，提示循环单轴应变力可促进BMSC向骨骼肌分化。

近来，一些磁力装置也被用来提高干细胞的归巢和定植能力。研究发现低频电磁场可影响BMSC的黏附力、增殖、分化以及生存能力[35]。磁力细胞定位系统与磁力细胞输送系统可促进移植的干细胞在损伤部位定植，Oshima等[36]发现将移植在损伤部位的105个BMSC处于强度为1.5 T，持续时间为10 min的磁场中可显著增强损伤的肌肉恢复。而Nakabayashi等[37]将磁力细胞输送系统用于采用铁羧葡胺和鱼精蛋白作为磁性标记的BMSC治疗胫骨前肌损伤，通过生物发光成像技术发现实验组有更多的BMSC定植在损伤部位与更好的骨骼肌功能恢复。

四、药物、细胞因子及细胞共培养在BMSC促进骨骼肌再生中的作用

5-氮杂胞苷（5-Azacytidine，5-AZA）是一种与胞嘧啶核苷类似的DNA甲基化抑制剂，15 μmol/L的5-AZA治疗BMSC可促进心肌和骨骼肌相关基因的表达[38]。研究证明由聚乙酸内酯构成的电纺纤维是一种与细胞外基质类似的装置，与5-AZA在肌管的生成和成熟方面起协同作用，并可促进5-AZA诱导的BMSC成肌分化能力[39]。BMSC可向多种细胞分化，但分化的产量一直处于较低水平，而Conforti等[40]为了克服这一缺陷，采用浓度为50 nm的逆转素预处理BMSC，发现能够显著促进BMSC大量分化为骨骼肌细胞。

干细胞治疗的最大障碍是不能归巢到损伤部位及低存活率，而采用一些细胞因子可有效改善这一缺陷。Xinaris等[41]发现在移植前采用胰岛素样生长因子1对BMSC进行预处理可增强迁移能力并能促进急性肾衰后功能的恢复。SDF-1/CXCR4与Notch信号通路可调节BMSC的迁移和功能，在BMSC迁移至损伤区域与促进创面肌肉血管再生方面起着不可或缺的作用[42-45]。虽然基质细胞衍生因子1（Stromal cell-derived factor1，SDF-1）并不会影响成肌细胞的分化与成肌调节转录因子的表达，但是它不仅可增强骨骼肌再生，还可促进成肌细胞与CD34或CXCR4阳性细胞的迁移，并且发现这种现象与基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9活性的增加有关，提示采用SDF-1预处理可增强BMSC修复骨骼肌的能力[46]。四跨膜蛋白超家族中的CD9和CD81蛋白在成肌细胞的融合和保护肌管的免受凋亡方面起重要作用[47]。在骨骼肌再生时，成肌细胞的CD9和CD81的表达会上调，但在肌再生过程中若同时缺乏CD9和CD81，便会迅速产生离散的营养不良的肌纤维，并发生肌管频繁的融合，从而导致异常的肌肉再生[48]。Brzoska等[49]采用SDF-1预处理BMSC，发现CD9蛋白水平和mRNA水平显著增高是通过活化CXCR4实现的。采用SDF-1预处理的BMSC与C2C12细胞共培养，显示有更多的混合肌管产生，从而证实SDF-1是通过以CXCR4依赖性的方式上调CD9的表达，从而诱导BMSC的迁移并促进成肌分化。在骨骼肌再生过程中，Pax3和Pax7是成肌分化中的关键基因，而Pax3作为胚胎肌源性程序的主要调节者，它的活化可抑制BMSC的成脂，成骨，成软骨分化，但却可促进BMSC成肌分化[50]。

Beier等[51]将BMSC与成肌细胞共培养，发现肌细胞增强因子2显著上调，当碱性成纤维细胞生长因子和地塞米松加入培养基时，显示更多的混合肌管生成。Witt等[52]发现将BMSC与成肌细胞共培养之后加入胰岛素样生长因子1和低氧诱导因子能够促进BMSC成肌分化，并表达结蛋白，肌细胞增强因子2、平滑肌肌动蛋白α及肌球蛋白重链2。

五、结论

BMSC的多向分化潜能使其在组织工程领域得到重视。大量研究已证实BMSC在损伤的骨骼肌修复与再生中的优势，但局部移植的BMSC归巢与存活率低仍是当前应用的最大障碍。肌肉再生是一个复杂的生物学过程，并且BMSC向骨骼肌分化的机制还不是完全清晰，未来不仅需要更多的实验以探索BMSC成肌分化的相关机制，还需要更多的临床研究证实BMSC在人体骨骼肌修复与再生的效果。